[发明专利]一种利用两亲性壳聚糖微球载体制备固定化脂肪酶的方法

权利要求书

1.一种利用两亲性壳聚糖微球载体制备固定化脂肪酶的方法，其特征在于，所述方法包括：

a.制备两亲性壳聚糖微球载体：该载体基质为微米级壳聚糖微球，将壳聚糖微球基质C₂位苯甲醛化，引入疏水相互作用基团，再用环氧氯丙烷活化C₆位羟基，偶联四乙烯五胺，制备兼具疏水作用苯基和亲水性多胺手臂分子的壳聚糖微球，具体制备过程如下：

⑴壳聚糖微球基质的制备：将质量分数为5%的壳聚糖溶液与PEG2000充分混合，PEG2000在溶液中的质量百分含量分别为3%，再加入与壳聚糖溶液等体积的液体石蜡及乳化剂span-80，高速搅拌30min使体系成乳液状，然后加入0.12倍壳聚糖溶液体积的甲醛，搅拌1h后将乳液倒入10﹪NaOH/无水乙醇(V(NaOH):V(无水乙醇)=1:1)的混合液中静置1h，用二甲苯、乙醇、去离子水充分洗涤，得到粒径100~300μm的壳聚糖微球作为基质；

⑵基质微球的基团修饰：称取壳聚糖微球于甲醇中，滴加苯甲醛，苯甲醛与微球质量比3~6，60℃恒温振荡反应10~16h，再加入硼氰化钠室温反应12h，抽滤洗涤后将微球浸泡在氢氧化钠水溶液中、缓慢加入环氧氯丙烷，环氧氯丙烷与微球质量比6~12，50℃振荡反应5h，抽滤洗涤后将环氧化微球置于乙醇中，加入氢氧化钠水溶液和四乙烯五胺，四乙烯五胺与微球质量比10~15，55℃反应6h，抽滤，用蒸馏水充分洗涤，干燥，得两亲性壳聚糖微球载体；

⑶戊二醛活化：取两亲性壳聚糖微球置于烧瓶中，按5倍氨基摩尔数的量加入戊二醛溶液，以乙醇作为反应介质60℃反应1.5h，抽滤，然后用蒸馏水、pH7.5的磷酸缓冲液洗涤，真空干燥，得戊二醛活化载体；

b. 制备固定化脂肪酶: 将戊二醛活化载体分散于磷酸缓冲液中, 室温下，加入脂肪酶，脂肪酶与载体的质量比为0.02~0.15:1，固定化温度为20~40℃，固定化时间为2~6h，固定化pH7.5~8.0,在摇床中振荡2~6h，吸去酶液，用磷酸缓冲液清洗固定化酶至洗液中不含蛋白，所得固定化酶放于4℃冰箱中保存即可。

2.根据权利要求1所述的一种利用两亲性壳聚糖微球载体制备固定化脂肪酶的方法，其特征在于，所述的疏水作用基团为苯基，亲水性手臂分子为多胺。

3.根据权利要求1所述的一种利用两亲性壳聚糖微球载体制备固定化脂肪酶的方法，其特征在于，所述两亲性壳聚糖微球载体的粒径为100~300μm。

4.根据权利要求1所述的一种利用两亲性壳聚糖微球载体制备固定化脂肪酶的方法，其特征在于，所述苯基密度为1.5-2.2mmol／g载体，氨基密度为2.8-3.6mmol／g载体。