[发明专利]一种利用两亲性壳聚糖微球载体制备固定化脂肪酶的方法

说明书

技术领域

 本发明涉及一种制备固定化脂肪酶的方法，特别是涉及一种利用两亲性壳聚糖微球载体制备固定化脂肪酶的方法。

背景技术

脂肪酶(EC.3.1.1.3)是一类特殊的酰基水解酶，为应用最广泛的酶催化剂之一，除了能够催化甘油酯类化合物的水解之外，还可以用于在非水相中催化酯交换、高聚物合成、多肽合成、立体异构拆分和手性药物的合成等。南极假丝酵母脂肪酶（Candida Antarctic lipase B，CALB）是一种重要的脂肪酶，在水解和有机合成反应中具有高度的立体选择性，对非水溶性和水溶性物质都有很强的催化活性。近年的研究成果表明，CALB在多种类型的反应中都显示了较其它脂肪酶更为出色的催化性能。脂肪酶价格昂贵，虽然游离酶催化反应技术成熟，但酶不能重复使用，难以实现过程的连续化，工业化成本高而难以推广。固定化脂肪酶，是非水相催化中的常用形式，可以克服游离酶催化的缺点。

应用于非水相中的固定化脂肪酶目前多采用吸附法制备，如诺维信公司生产的Novozyme 435（吸附固定于大孔丙烯酸树脂的CALB），但即使在非水相中仍然存在酶从载体上脱落的问题。共价结合法具有酶与载体结合牢固，可长时间连续重复使用的优点，符合工业化应用的要求。构建性能优良的载体往往是酶固定化成功与否的关键。研究表明，载体表面接枝手臂分子有利于提高固定化酶活性[Barbara Krajewska．Application of chitin-and chitosan-based materials for enzyme immobilizations：a review．Enzyme and Microbial Technology，2004，25：126-139]，具适当疏水表面的载体比具亲水表面的载体更适于用作脂肪酶固定化载体[Petkar M,Lali A, Caimi P, Daminati M.Immobilization of lipases for non-aqueous synthesis. J Mol Catal B Enzym,2006,39:83-90]。但Blanco等[Blanco R M, Terreros P, Munoz N, et al. Ethanol improves lipase immobilization on a hydrophobic support. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic,2007, 47: 13-20]指出疏水性太强的载体也并不一定是最好的，疏水性太强的表面在与水分子接触时，其接触角往往大于90°，导致水相不能进入到内部，因而载体只能在其外部吸附一些酶蛋白，减少了载体的载酶量。壳聚糖是一种性质优良的固定化载体，生物相容性好、无毒、具有许多可供改性且亲水的氨基和羟基。然而，目前采用壳聚糖特别是改性壳聚糖微球载体共价固定化脂肪酶的报道还很少，这些研究或未将壳聚糖制备成可大量生产的微米级微球，或是制备的壳聚糖微球未连接手臂分子，也没考虑到给微球表面提供适当的疏水区，这必然影响到制备高活力的固定化脂肪酶，所以开发性能优良的壳聚糖基脂肪酶固定化载体仍很有必要。基于此，我们以反相悬浮交联法制备微米级壳聚糖微球树脂作为固定化载体基体，将壳聚糖微球基质C₂位苯甲醛化，引入疏水相互作用基团，再用环氧氯丙烷活化C₆位羟基，偶联四乙烯五胺，制备兼具疏水作用苯基和亲水性多胺手臂分子的壳聚糖微球，经偶联戊二醛后作为酶的共价固定化载体。采用该载体对南极假丝酵母脂肪酶进行固定化，提高固定化酶活力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用两亲性壳聚糖微球载体制备固定化脂肪酶的方法，以反相悬浮交联法制备微米级壳聚糖微球树脂作为固定化载体基体，疏水性基团和亲水性手臂分子的引入，极大提高了壳聚糖微球对脂肪酶的固定化效率。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种利用两亲性壳聚糖微球载体制备固定化脂肪酶的方法，所述方法包括：

a.制备两亲性壳聚糖微球载体：该载体基质为微米级壳聚糖微球，将壳聚糖微球基质C₂位苯甲醛化，引入疏水相互作用基团，再用环氧氯丙烷活化C₆位羟基，偶联四乙烯五胺，制备兼具疏水作用苯基和亲水性多胺手臂分子的壳聚糖微球，具体制备过程如下：