[发明专利]胆管上皮细胞的高效扩增和培养方法

权利要求书

1.胆管上皮细胞的高效扩增和培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）上皮细胞分离，纯化，培养；

（2）细胞生长线测定；

（3）鉴定。

2.根据权利要求1所述的胆管上皮细胞的高效扩增和培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）上皮细胞分离，纯化，培养：取5－20克的肝脏组织，剪成面积为1mm³的组织块，在磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)中浸泡洗涤3次后，在37℃温度下，用含5mg/ml IV型胶原酶的DMEM高糖培养基消化组织块30-60分钟，收集细胞并于1200r/min下离心5min，重复3遍后，去除胶原酶，得分离的肝胆管上皮细胞，并进行纯化；将纯化后的肝胆管上皮细胞分别以50个细胞/cm²接种于事先配置好的培养基中，于37℃、5%的CO₂中培养6-10天后，无菌条件下将胆管上皮细胞集落切割，每20 -50个细胞团块作为一个，并转移至新的培养皿或者培养板中进一步传代培养；

（2）细胞生长线测定：将细胞以每孔5×10³个细胞接种于有matrigel包被的4孔板中，置于37℃ 、5%的CO₂培养，分别于培养的第5-7天测定细胞浓度，其中，四孔板每孔加入培养液的体积500μl；

（3）培养细胞的鉴定包括免疫细胞化学染色和胆管样结构形成，

a．免疫细胞化学染色：用4%多聚甲醛在室温下固定培养的胆管上皮细胞，20 min 分钟后，吸掉4%多聚甲醛，加入0.4%Triton X-100透膜15 min，用PBS冲洗3遍后；加入5%的羊血清，室温下封闭0.5 h；加入一抗，37℃孵育40 min或4℃过夜，去掉一抗，PBS冲洗3次后，进行显色并检测，其中，每次检测的细胞数为1 000个；

b. 胆管样结构形成：将Matrigle 用DMEM以1:1稀释, 包被在培养皿/培养板上形成5mm厚的三维Matrigle培养体系，1h后将5代内的胆管上皮细胞以1×10⁵/cm²细胞密度接种在三维Matrigel培养体系上培养5－7天，其中，培养液为：DMED/F12 中加入10%FBS, 20ng/ml HGF, 1×ITS和2mM 谷氨酸。

3.根据权利要求2所述的胆管上皮细胞的高效扩增和培养方法，其特征在于，所述的纯化方式为：按细胞裂解液：细胞体积比为5:1，向分离的肝胆管上皮细胞中加入红细胞裂解液，充分混匀，红细胞充分裂解后，配平，以1200r/min的速度离心5分钟重复三遍，裂解红细胞；收集细胞，将细胞悬浮于DMEM溶液中，50g/min离心1min，重复三遍，收集上清液中的非实质性肝细胞。

4.根据权利要求2所述的胆管上皮细胞的高效扩增和培养方法，其特征在于：步骤（1）中，培养所用的培养皿或培养板均预先用250 μg/ml matrigel于37℃包被1h。

5.根据权利要求1-4任一项所述的胆管上皮细胞的高效扩增和培养方法，其特征在于，所述的胆管上皮细胞培养基成分为：α-MEM/DMEM+ FBS + ITS + 10nmol/L Y-27632 + 100μg/ml 青链霉素，其中，α-MEM与DMEM的质量比为1:1。