[发明专利]胆管上皮细胞的高效扩增和培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种兔肝内胆管上皮细胞的高效扩增和培养方法，属于生物医药技术领域。

背景技术

胆管上皮细胞异常病理可引发包括胆道闭锁和原发性胆汁肝硬化等在内的多种疾病，研究这些疾病发病机制的其中一个理想方法是建立体外的胆管上皮细胞可扩增培养体系。采用不同的分离纯化方法，研究人员已先后从人和啮齿类动物胆管组织中分离培养出胆管上皮细胞，迄今尚未见到兔胆管上皮细胞分离培养的研究报道。兔子是常用的实验动物，取材经济方便，兔子肝脏的多方面生理及生化指标与人类有许多相似的特点，因此是人类肝脏疾病动物模型重要的补充。

目前，国内外报道成功的正常肝内胆管上皮细胞的培养方法主要组织块培养法，密度梯度离心法和细胞分选法等，但这些方法存在细胞纯度不高，体外培养的原代胆管上皮细胞增殖能力弱，无法进行长时间的可扩增培养，以及研究材料往往需要涉及整肝组织，肝组织消耗较大等缺陷，如：细胞分选法是获得高纯度胆管上皮细胞的有效方法，但细胞分选需要有专门的分选设备如流式细胞仪，分选获得的单个细胞也并十分适合胆管上皮细胞的生长，且目前缺乏胆管上皮细胞的特异性表面标志物，这些因素制约着细胞分选技术的开展应用；密度梯度离心法可以在一定程度上纯化胆管上皮细胞，但也不可避免地混合其他种类的细胞如肝星型细胞和成纤维样细胞，因而细胞纯度不高；组织块培养法优点是最大程度地保留了体内胆管上皮细胞的生物学特性，因而也具有较好的生长活性，但这一方法同样可以促进成纤维样细胞、肝细胞与胆管上皮细胞的混合生长，纯度较低；国内外可供应用的正常肝内胆管上皮细胞株很少，性状不稳定，容易发生恶性转化；尽管已有一些胆管上皮细胞分离培养的研究报道，但研究结果显示已有的大部分培养体系无法长时间地维持细胞的增殖，即使在添加EGF和HGF等细胞因子的情况下，也只能适当延长细胞的存活时间，效果并不十分显著。

有基于此，做出本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种胆管上皮细胞的高效扩增和培养方法。

实现本发明目的所采取的技术方案如下：

肝胆管上皮细胞的高效扩增和培养方法，包括如下步骤：

（1）上皮细胞分离，纯化，培养；

（2）细胞生长线测定；

（3）鉴定。

其中：

（1）上皮细胞分离，纯化，培养：取5－20克的肝脏组织，剪成约1mm³的小块，在磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)中浸泡洗涤3次后，在37℃的摇床中，用含5mg/ml的IV型胶原酶的DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）高糖培养基消化组织块30-60分钟，收集细胞1200r/min离心5min，重复3遍去除胶原酶；纯化肝胆管上皮细胞，将纯化后的肝胆管上皮细胞分别以克隆状密度（50细胞/cm²）接种于事先配置好的培养基(DMEM+10%FBS（fetal bovine serum, 胎牛血清）+ITS（Insulin-Transferrin-Selenium)中，于37℃、5%（体积体积比）的CO₂中培养6-10天后，无菌条件下用玻璃分针切割胆管上皮细胞集落为小细胞团（20个-50个细胞团块），并转移至新的培养皿或培养板中进一步传代培养。

（2）细胞生长线的测定：将细胞以每孔5×10³个细胞接种于有matrigel包被的4孔板中，每孔体积为500μl，置于37℃的5%（体积比）CO₂中培养，分别于培养的第5-7天消化收集并测定细胞浓度。

（3）培养细胞的鉴定包括免疫细胞化学染色和胆管样结构形成，a．免疫细胞化学染色：用4%（体积比）多聚甲醛在室温下固定步骤（1）培养的胆管上皮细胞20 min（加入多聚甲醛前吸掉培养基，并用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)清洗2-3遍），加入0.4%（体积比）Triton X-100透膜15 min，用PBS冲洗3遍后；加入5%（体积比）的羊血清，室温下封闭0.5 h，加入一抗，37℃孵育40 min或4℃过夜，去掉一抗后，PBS冲洗3次后，进行DAB（辣根过氧化酶检测试剂盒）显色，倒置显微镜下检测，每次实验检测的细胞数大约为1 000个；