[发明专利]利用线虫幼虫检测塑化剂的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测塑化剂的方法。

背景技术

塑化剂为邻苯二甲酸酯同系物。包括DEHP、DINP、DNOP、DBP、DMP、DEP等6种邻苯二甲酸酯类塑化剂，2011年6月1日卫生部紧急发布公告，将邻苯二甲酸酯(也叫酞酸酯)类物质，列入食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单。而2012年年底被曝光的“酒鬼”酒塑化剂超标2.6倍，引起人们关于塑化剂及对白酒特别是高档酒食品安全的恐慌和质疑。

作为一种环境激素，塑化剂对人和动物会造成免疫力及生殖力下降。目前各国可容忍的60公斤成人每日摄取量范围为1.2-8.4毫克，一些研究表明塑化剂对幼儿的潜在危害会更大，表现出一定的发育毒性。邻苯类塑化剂用量巨大，使用范围广，污染面积和影响人数就都蔚为可观，目前邻苯二甲酸酯类可以说是全球分布最为广泛的一类人工合成环境污染物，在空气、水、土壤和灰尘中都可以检测到。邻苯二甲酸酯类在生物体重还有富集作用，水生生物体内有明显的该类化合物的残留物，最终人们通过食物和空气等途径暴露其中。关于塑化剂的检测尚无统一标准。常规化学检测和仪器分析中存在操作复杂，仪器依赖度大，成本高的不足。

发明内容

本发明为了解决解决常规的塑化剂检测方法中操作复杂、仪器依赖度大、成本高的技术问题，提供了一种利用线虫幼虫检测塑化剂的方法。

利用线虫幼虫检测塑化剂的方法如下：

一、称取1.0g胆固醇，溶于无水乙醇中，配制成浓度为10mg/ml的胆固醇乙醇溶液；

二、配制磷酸盐缓冲液：称取13.6g KH₂PO₄、1.8g KOH，加蒸馏水定容至100mL，调节pH值为6.0；

三、将15～20g琼脂粉、2～3g蛋白胨、0.10～0.12g CaCl₂、0.11～0.13g MgSO₄和2～3g NaCl加入到1000mL的烧杯中，加入1ml胆固醇乙醇溶液和25mL磷酸盐缓冲液，用蒸馏水定容至1000ml；

四、将烧杯封口，放入高压蒸汽灭菌锅中于120℃灭菌15～25min，然后降温至50～60℃，在无菌环境下加入0.5～5ml待测白酒，然后将混合物在无菌环境下倒入培养皿中，在温度为20℃的无菌环境下干燥8h～12h，即得线虫培养基；

五、向线虫培养基中均匀涂入浓度为1×10⁹个/mL～2×10⁹个/mL大肠杆菌OP50菌液0.8～1.2mL，于37℃培养8～12h，接入8～12条L2期的线虫幼虫，培养12h，然后观测L2期线虫死亡率，虫幼虫死亡率＞10％，则表明待检测白酒含有塑化剂。

本发明通过测定线虫L2期幼虫死亡率，借助塑化剂对线虫L2期幼虫的特殊毒性鉴定白酒中是否含有塑化剂。适量酒精对线虫各阶段的发育没有影响，将微量白酒添加入线虫培养基中，如果此培养基上生长的线虫幼虫出现明显死亡，便可确定此类白酒还有塑化剂。

本发明与传统的利用分析仪器鉴定白酒中塑化剂的方法相比，敏感度高，利用线虫胁迫响应特性，可以直观高效的确定白酒中是否含有塑化剂。

本检测方法对实验条件要求低，不需要特殊的高精分析仪器和检测设备，实验操作方便，成本低廉，易于掌握。

附图说明

图1是实验一至实验四中每条线虫L2期幼虫存活率的柱状图，图中a表示实验一中每条线虫L2期幼虫存活率的柱状图，b表示实验二中每条线虫L2期幼虫存活率的柱状图，c表示实验三中每条线虫L2期幼虫存活率的柱状图，d表示实验四中每条线虫L2期幼虫存活率的柱状图，e表示实验五中每条线虫L2期幼虫存活率的柱状图，f表示实验六中每条线虫L2期幼虫存活率的柱状图，g表示实验七中每条线虫L2期幼虫存活率的柱状图，h表示实验八中每条线虫L2期幼虫存活率的柱状图，i表示实验九中每条线虫L2期幼虫存活率的柱状图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式利用线虫幼虫检测塑化剂的方法如下：

一、称取1.0g胆固醇，溶于无水乙醇中，配制成浓度为10mg/ml的胆固醇乙醇溶液；

二、配制磷酸盐缓冲液：称取13.6g KH₂PO₄、1.8g KOH，加蒸馏水定容至100mL，调节pH值为6.0；