[发明专利]双顺反子共表达基因转移体及制备方法

权利要求书

1.一种双顺反子共表达基因转移体，其特征在于：基因转移体的基因序列为：SEQ ID No.15。

2.根据权利要求1所述的双顺反子共表达基因转移体，其特征在于：所述基因转移体从5＇端起到3＇端止依次包括有牛核基质结合区MAR、人工构建的组合启动子CAG、抑制蛋白基因FSTN、内部核糖体进入位点IRES、绿色荧光蛋白AcGFP基因、Rabbit globin polyA信号区。

3.根据权利要求2所述的双顺反子共表达基因转移体，其特征在于：所述核基质结合区MAR的序列通过如下引物进行PCR获得：

CAG前的MAR序列：

CMAF1正义链，5＇到3＇：SEQ ID No.9；

CMAR2反义链，5＇到3＇：SEQ ID No.10；

PolyA后的MAR序列：

PMF1正义链，5＇到3＇：SEQ ID No.11；

PMR2反义链，5＇到3＇：SEQ ID No.12。

4.根据权利要求2所述的双顺反子共表达基因转移体，其特征在于：所述核基质结合区MAR的序列为：SEQ ID No.13。

5.根据权利要求2所述的双顺反子共表达基因转移体，其特征在于：所述抑制蛋白基因FSTN的序列通过如下引物进行PCR获得：

FMF1正义链，5＇到3＇：SEQ ID No.7；

FMR2反义链，5＇到3＇：SEQ ID No.8。

6.根据权利要求2所述的双顺反子共表达基因转移体，其特征在于：所述抑制蛋白基因FSTN的序列为：SEQ ID No.14。

7.一种双顺反子共表达基因转移体的制备方法，其特征在于，步骤如下：

第一步，由pCAGEN载体上的CAG启动子移植并替换pCMV-IRES2-AcGFP1，中的CMV，同时以pCAGEN载体上Rabbit globin polyA移植并替换pCMV-IRES2-AcGFP1中的SV40polyA，构建载体pCAG-IRES2-AcGFP1；

第二步，FSTN外源基因的获得和插入pCAG-IRES2-AcGFP1载体；

第三步，MAR序列的获得和插入pCAG-IRES2-AcGFP1载体；

第四步，质粒载体pMAR-CAG-FSTN-IRES-AcGFP1-polyA-MAR构建完毕后，用Sac Ⅰ、Afl Ⅱ双酶切，获得MAR-CAG-FSTN-IRES-AcGFP1-polyA-MAR双顺反子共表达基因转移体。

8.根据权利要求7所述的双顺反子共表达基因转移体的制备方法，其特征在于：所述步骤第一步，进一步的具体步骤包括：

⑴插入T片段，改变酶切位点：从PMD19T-simple vector上获得T片段，通过酶切位点将该片段连入载体，改变载体上原有酶切位点的顺序；

⑵CAG启动子的插入：将CAG启动子从pCAGEN载体上切下，连入到上述载体中；

⑶Rabbit globin polyA的获得和插入：从pCAGEN载体上获得Rabbit globin polyA序列，通过两个酶切位点将获得的Rabbit globin polyA序列插入到载体pIRES2-AcGFP1中；

⑷CMV启动子的切除：将CMV启动子从载体pIRES2-AcGFP1上切除；

⑸补齐pUC后半段：根据pUC的基因序列设计引物，通过PCR反应获得pUC序列的后半段，通过两个酶切位点将获得的片段连入到载体pIRES2-AcGFP中，至此，载体pCAG-IRES2-AcGFP1构建完毕。