[发明专利]双顺反子共表达基因转移体及制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域中的基因工程技术，具体涉及一种双顺反子共表达基因转移体的制备方法。

背景技术

在转基因动物中外源基因的高效表达必须依赖好的表达载体。影响外源基因高效表达的因素很多，如启动子、甲基化、基因本身结构、插入位点、调控序列（增强子、绝缘子、核基质结合区)等。

CAG启动子是人工构建的组合启动子，由巨细胞病毒（the cytomegalovirus，CMV)早期增强子（early enhancer element）和鸡β-肌动蛋白（chicken beta-actin）启动子组成，CAG启动子是非特异性的组成型启动子，用于驱动基因在哺乳动物载体的高水平表达。CMV是常用的启动子，在我们转基因羊的应用中，发现在转基因个体中发生甲基化，导致转基因的沉默。

核基质结合区(MARs)是真核生物染色质中与核基质或核骨架特异结合的一段DNA序列。MARs参与DNA复制调控和转录调控等多种核生化过程。

MA Rs的长度一般为300一1000bp，也有的长达几个kb，维持其活性的最小长度约是300bp，MARs是非编码序列，AT含量高达70%，不同的MARs序列不同，但往往含有相似的结构基元，如烟草中发现TM2序列具备一般MARs序列的基本特征：其序列全长1001bp，AT含量为62.8%，序列上含有一个典型的T-box,两个潜在的DNA解旋序列（AATATT）和一个潜在的拓扑异构酶II结合位点（CTTTATATTGTTGAC）。

研究表明，MARs序列的功能包括边界因子(boundarye lement)作用、染色质调节作用、DNA复制起始子的组分、染色体结构组成作用、MARS对转基因表达的调控作用，鉴于MARs与基因表达间的关系，尤其它能显著地增强转基因表达、克服位置效应、消除转基因沉默，它已被作为一种顺式调控元件应用到转基因技术中。

FSTN，全称叫卵泡抑素(Follistatin，FST)又名FSH抑制蛋白,是一种单链糖蛋白,最初是从牛和猪的卵泡液中分离出来的，因而被称作卵泡抑制素。以旁分泌或自分泌的方式，与转化生长因子-β(TGF-β)超家族的许多成员，如骨形态发生蛋白(BMP)、肌肉抑素(MSTN)等结合,其中MSTN是目前所知的最强的骨骼肌生长抑制物。FST蛋白能够同MSTN黏合在一起，阻断其抑制功能，从而促进肌肉的生长。

IRES序列，内部核糖体进入位点序列，真核生物大多数蛋白质合成采用了依赖帽子结构的翻译起始方式.但一组缺乏帽子结构的RNA病毒的蛋白质合成起始是依赖其5′端非翻译区(untranslated region,UTR)，即内部核糖体进入位点（IRES），该位点是一段高度保守序列,可使其前后基因在同一启动子下转录一个双顺反子mRNA,而转译时使两基因分别翻译成两个独立的产物。因此，在真核生物转基因表达载体构建中，常用于构建在一个启动子下IRES连接两个基因编码序列，实现双顺反子共表达。能实现双顺反子共表达的还有1）.Fusion基因融合2）.cis trans Proteas顺反蛋白酶3）Reintiation再开始4）Splicing剪接（基因之间设计酶切位点5）.Internal Promoter中间启动子6）手足病病毒2A等。

近年来利用去除质粒载体主干序列的基因表达盒（仅包括启动子、编码区和终止子）作为基因转移体，也称为洁净ＤＮＡ转化（ｃｌｅａｎＤＮＡｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ），主要是通过基因枪转化植物，已在水稻、棉花、小麦、葡萄转化中获得成功应用，利用花粉管导入法在甜瓜中也成功利用，很少见在转基因动物尤其哺乳动物中的构建与应用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种双顺反子共表达基因转移体的制备方法，提供能使两种目的基因作为双顺反子高效共表达，无质粒载体主干序列、无抗性等选择标记、为洁净和安全性的双顺反子共表达基因转移体。

本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：

一种双顺反子共表达基因转移体，基因转移体的基因序列为：SEQ ID NO：15。

而且，所述基因转移体从5＇端起到3＇端止依次包括有牛核基质结合区MAR、人工构建的组合启动子CAG、抑制蛋白基因FSTN、内部核糖体进入位点IRES、绿色荧光蛋白AcGFP基因、Rabbit globin polyA信号区。

而且，所述核基质结合区MAR的序列通过如下引物进行PCR获得：

CAG前的MAR序列：