[发明专利]高粘附性丁酸梭菌及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因重组领域，具体来说是一种基因重组后的丁酸梭菌及其制备方法。

背景技术

丁酸梭菌（Clostridium butyricum）是一种新型的益生菌。丁酸梭菌又名酪酸菌，它是梭状芽孢杆菌属中的一个种，是1933年由日本千叶医科大学宫入近治博士首先发现并报告的，因此又叫宫入菌。1935年，Kingi Miyairi博士从人的粪便和土壤中分离出丁酸梭菌，随后发现其厌氧培养的过滤物中含有较少的脂肪酸，具有极强的整肠作用，它可抑制肠道中的致病菌，促进肠道中有益菌如双歧杆菌和乳杆菌的生长。丁酸梭菌具有以下作用，（1）丁酸梭菌能有效的抑制引起疾病的葡萄球菌、念珠菌、克雷伯菌、弯曲杆菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、痢疾杆菌和伤寒沙门氏菌以及腐败菌的繁殖，调整肠道微生态恢复平衡，同时也减少了氨类、胺类、吲哚类和硫化氢等有害物质的产生（这些产物如果被肠吸收可损害肝功能）。（2）丁酸梭菌可以激活免疫系统，促进免疫功能，维持机体的健康状况。（3）丁酸梭菌在肠道内能产生淀粉酶、蛋白酶、糖苷酶、纤维素酶，对肠道上皮组织的再生和修复有很重要的意义。但是，在丁酸梭菌的应用过程中，其较低的粘附性能严重影响了它的应用效果，因为大部分丁酸梭菌不能在动物肠道中定植，需要不断的从外界补充，目前研究主要集中在提高丁酸梭菌的产量，例如申请号为201110324228.2的专利文献公开了一种工业化生产超高细胞浓度的丁酸梭菌的方法,大大增加了它的应用成本。 

发明内容

本发明解决的技术问题是，提供一种用具有高粘附性的丁酸梭菌及其制备方法,该方法将乳杆菌的粘附蛋白（adhension protein,AP）的基因转移到丁酸梭菌中进行表达,从而提高丁酸梭菌的粘附能力。

本发明的技术方案如下：

本发明制得的高粘附性丁酸梭菌重组菌株是携带重组质粒的丁酸梭菌，所述的重组质粒是含乳杆菌粘附蛋白基因的枯草芽孢杆菌质粒pHY300PLK。

本发明所需的乳杆菌粘附蛋白基因可以从乳杆菌中扩增出来,所用引物为：5＇-CGCGGATCCATGAATACTGTTGCTCCTC-3＇和5＇-CCGGAATTCATTTTTTTTACGTTTTTTTT-3＇（引物合成自上海生工生物工程技术服务有限公司）。

所述的乳杆菌粘附蛋白基因的核苷酸序列为SEQ ID No:2。

所述的乳杆菌粘附蛋白基因编码的粘附蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No:1。

一种利用基因工程技术制备高粘附性丁酸梭菌的方法，特征在于利用携带乳杆菌粘附蛋白基因编码区的重组表达载体，采用任何转基因方法在丁酸梭菌中表达乳杆菌粘附蛋白，从而提高丁酸梭菌的粘附能力。其步骤如下：

（1）             采用基因克隆的方法获得乳杆菌粘附蛋白基因编码区；

（2）             把乳杆菌粘附蛋白基因编码区连于表达调控序列，形成重组表达载体；

（3）             采用任何转基因方法将重组表达载体转化至丁酸梭菌中；

（4）             在特定的条件下筛选和鉴定丁酸梭菌转化子；

（5）             在适合的条件下培养丁酸梭菌阳性克隆，获得基因重组后的丁酸梭菌。

本发明涉及的重组菌株是携带重组质粒的丁酸梭菌，所述的重组质粒是含乳杆菌粘附蛋白基因的枯草芽孢杆菌质粒pHY300PLK。用上述方法获得重组丁酸梭菌，其特征为：导入了乳杆菌的粘附蛋白基因序列，可表达粘附蛋白，从而提高了粘附能力，可大大提高其在动物肠道中的定植能力。

所述的高粘附性丁酸梭菌，对于抗生素引起的鸡、猪腹泻，有较强的治疗作用，最佳使用量为10⁶个／千克体重。

所述的高粘附性丁酸梭菌，与壳聚糖、低聚寡糖（如低聚木糖、甘露寡糖等）等混合使用，效果更佳，最佳重量比例为1:1-100:1-100。

所述的高粘附性丁酸梭菌，用于水产养殖或改善水质，所用浓度为10⁴个／毫升。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒等。

在本发明中，术语“任何转基因方法”包括电击法基因转化、超声波介导基因转化、显微注射介导基因转化、激光微束介导基因转化、基因枪法介导基因转化、根癌农杆菌Ti质粒介导基因转化、发根农杆菌Ri质粒介导基因转化等。