[发明专利]非放射性判别膜蛋白质转运功能的方法

说明书

 

技术领域

本发明涉及膜蛋白质功能判别技术领域，尤其涉及一类非放射性判别膜蛋白质转运功能的方法。

 

背景技术

膜蛋白结构与功能的研究作为研究药物靶向性的基础对治疗疾病的发展是必不可少的。目前研究膜蛋白功能的普遍方法主要是以结构为基础的功能性研究，并且生物信息学技术作为核心方法被广泛的应用到对蛋白的结构以及功能方面进行预测。首先，通过在数据库中搜索目标蛋白的序列信息并且进行比对，包括同源序列，拓扑结构，功能团，进化，具体功能相关序列分析等。在预测结构的基础上，膜蛋白的功能研究还主要依赖各种现代生物物理仪器，包括质谱仪，核磁共振仪，X射线仪，红外/紫外/光散射光谱仪等。但是，由于膜蛋白不易于过表达，纯化甚至是结晶，再加上无法确保膜蛋白的天然构象，因此在其转运功能方面的研究还是面临很大的困难的。

目前已经有很多文献通过应用放射性元素示踪的方法报道和研究了相关膜蛋白的转运功能，主要的研究方法是利用脂质体结构的特性模拟细胞膜结构，将目的蛋白插入到脂质体结构的表面。首先用做好的带有转运蛋白的膜结构包裹放射性元素标记的底物。在该混合物的基础上添加放射性元素标记的底物交换物。允许转运反应发生一段时间后应用蛋白抑制剂停止膜蛋白上的转运活动。最后，通过比较同位素标记的底物以及被交换物与各自标准含量的差别从而判断蛋白转运的情况。

同位素示踪法是利用放射性核素作为示踪剂对研究对象进行标记的微量分析方法，其主要原理是利用核探测器随时追踪放射性同位素不断地放出的特征射线，从而示踪同位素在体内或体外的位置、数量及其转变等。目前应用比较广泛的是放射性同位素法。该方法的优点在于其灵敏度高，测量方法简便易行，能准确地定量，准确地定位及符合所研究对象的生理条件等特点。稳定同位素因作为一种不释放射线的示踪剂，其灵敏度较低，可获得的种类少，而且价格较昂贵导致它的应用范围受到限制。就该方法的优点而言，膜蛋白上的转运活动的确能够准确的定位以及定量，但是，即便采取放射防护措施，放射性元素的对机体的损害也是难以避免的。操作者的损害程度与放射照射量，放射照射时间，以及放射射线种类都有直接关系。放射可以导致机体组织器官发生病变直至诱发癌变，并且会引发遗传缺陷。更重要的是放射性污物会污染环境进而影响他人的身体健康。除了健康隐患外，该方法不仅价格昂贵，操作需要的用量以及操作形式都需要谨慎。更重要的是该方法对实验环境的要求很高，需要在对周围环境没有污染的，严格密闭的条件下进行操作，并切配备先进的生物物理仪器。同位素失踪法已经为研究膜蛋白转运功能方面提供了不可小视的贡献，但是就该方法的推广性以及安全性而言，该方法也有它不可避免的弊端。

除了同位素示踪法，另外一种被广泛应用研究膜蛋白转运功能的方法是通过检测在线粒体上转运后的物质与其他胞内物质反应后的生成物从而判断是否转运的方法。例如研究腺甘酸转运体（ANT4）转运ATP/ADP的功能，通过添加不同浓度的ADP，并且在不同浓度条件下检测NADPH的生成而判断ATP的生成。该方法虽然在体外水平能够保持天然膜蛋白的功能，但是实验准备条件苛刻，耗时长，需要大量培养细菌并且以及提取新鲜的线粒体。