[发明专利]一种烟草黑胫病抗性的快速鉴定方法

说明书

技术领域

本发明属于作物抗病性鉴定技术领域，具体而言，涉及一种烟草黑胫病抗性的快速鉴定方法。 

背景技术

烟草黑胫病（Phytophthora parasitica var.nicotiane）是烟草生产上最具毁灭性的病害之一，是制约我国各烟区烟叶生产的最重要因素，可以危害烤烟、晾烟、晒烟、白肋烟、香料烟等所有的栽培烟草。1896年，Bred de Haan 在爪哇首次发现烟草黑胫病。1924年，Cook 在波多黎再吃观察到这个病害。此后，世界各主要产烟区陆续报道了烟草黑胫病发生为害情况，现该病已遍布温带、亚热带和热带各烟区。20世纪40年代，病区扩大到黄河流域、长江流域及珠江流域的各产烟省，在这些地区烟草黑胫病均已造成严重损失。据不完全统计，我国烟草黑胫病平均每年发病面积高达76373hm²，产量损失2869.26万kg，产值损失超过1.23亿元，仅次于烟草病毒病。生产实践表明，防治黑胫病最经济、有效、环保的措施就是选育抗病品种，抗性鉴定自然成为抗源挖掘利用、抗病育种、抗性监测等工作中重要的一环。因此，准确有效的抗性鉴定方法对烟草抗性材料的鉴定和抗病品种的选育是至关重要的。 

在以往黑胫病抗性材料的鉴定中，一般采用苗期接种鉴定和/或病圃抗性鉴定，主要根据黑胫病的发病特征——植株的萎蔫率来确定材料的抗性水平。其中，病圃抗性鉴定主要应用于烟草成株鉴定，其鉴定结果易受地块菌落浓度的均匀性及其气候影响，导致不同年份之间的鉴定结果存在一定的差异，而且病圃鉴定也因面积有限，无法同期对大批量的材料进行抗性鉴定；苗期接种鉴定在一定程度上克服了病圃鉴定的局限性，但在应用过程中由于接种苗龄、接种方法、病菌株系以及培养环境的不同，鉴定结果往往也不一致。上述两种方法的鉴定结果只是反映了烟草苗期或成株期对黑胫病菌的耐受能力，而并非是该品种或材料的真正抗性水平，原因在于：在烟草的种植过程中往往存在潜性感染现象，即黑胫病菌通过植株根部伤口，入侵植株后在茎秆等维管束内不断扩繁延伸，只有当植株体内菌落数达到一定时，植株才表现出萎蔫症状；同时，不同抗性材料对抑制黑胫病菌扩繁延伸的能力也是不同的，故单纯依靠植株病症表现来判断，还无法真实评价出不同材料的抗性水平。 

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种操作简单、成本低、速度快、准确性高、适宜烟草育种研究中的黑胫病抗性鉴定方法，以加速烟草抗黑胫病新品种的选育或突变基因的筛选与推广应用。 

为了实现上述目的，本发明的技术方案是： 

一种烟草黑胫病抗性的快速鉴定方法，包括如下步骤： 

（1）取待鉴定的烟草种子表面消毒； 

（2）烟草黑胫病菌的培养及其分生孢子悬浮液的制备；这里的烟草黑胫病菌为烟草黑胫病菌（Phytophthora parasitica var.nicotianae(vom Breda de Hean) Tuker）（0号小种）。 

（3）烟草黑胫病菌毒素液的提取：将步骤（2）制备的分生孢子悬浮液稀释为1×10⁵～5×10⁶个孢子含量，滤纸过滤，滤液高速离心，取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，得无菌的烟草黑胫病菌毒素液； 

（4）将步骤（1）表面消毒后的烟草种子用步骤（3）提取的毒素液浸泡4-8h，然后将烟草种子移到琼脂水培养基上，保持在相对湿度90%-95%、光照强度为10001x-2000lx、温度在18℃-25℃的条件下，7-10d后开始观察发芽情况，根据发芽率判断供试材料的抗性：发芽抑制率≥50%为感病品种，15%≤发芽抑制率在＞50%为中抗品种，发芽抑制率＜15%为抗病品种。 

上述的烟草黑胫病抗性的快速鉴定方法，其中步骤（1）按如下方法操作：取待鉴定的烟草种子置于无菌培养皿中，用1%（质量体积百分比）硫酸铜溶液浸种5min，然后用无菌水冲洗3次。 

上述的烟草黑胫病抗性的快速鉴定方法，其中步骤（2）按如下方法操作：将烟草黑胫病菌接种于燕麦固体培养基中，28℃培养7-14d，待菌丝长满整个培养皿后，取菌块加入到燕麦液体培养基中28℃振荡7-14d，得烟草黑胫病菌分生孢子悬浮液。 

上述的烟草黑胫病抗性的快速鉴定方法，其中所述的燕麦固体培养基的制作方法为：在1000mL无菌水中加入33g燕麦片，煮至燕麦片开花状，加18g琼脂粉，定容1000mL，分装入500mL三角瓶中高压120℃灭菌20min。