[发明专利]利用高通量组织芯片检测BSP在脑胶质瘤中的表达的方法

说明书

技术领域

本发明属于检测BSP在脑胶质瘤中的表达领域，特别涉及一种利用高通量组织芯片检测BSP在脑胶质瘤中的表达的方法。

背景技术

胶质瘤是中枢神经系统（CNS）中最多见的肿瘤，其中70%是恶性胶质瘤，是CNS起源的肿瘤中最常见和最致命的肿瘤，具有高复发率和死亡率。胶质瘤中最有生物学侵袭性的亚型是多形性胶质母细胞瘤（GBM，WHO IV级的星形胶质细胞瘤），其预后令人沮丧。目前的标准治疗方案包括最大程度的切除肿瘤以及随后使用DNA烷化剂、替莫唑胺进行化疗和放疗。但尽管经过上述的有效治疗，GBM和间变型星形细胞瘤（WHO III级）的预后生存期仍很短，中位生存期分别只有约14-16个月和2-5年。

目前已做了大量的努力来鉴定GBM中的基因学变化或其分子靶标，这些基因变化或分子靶标有助于区分GBM患者的不同亚组，每个亚组有不同的预后和对特异性治疗不同的临床反应。替莫唑胺临床反应最主要的决定因素之一是MGMT的甲基化水平。MGMT启动子甲基化可见于40%-60%的病人，并与对替莫唑胺治疗的良好反应相关。最近，在多达75%的2级和3级弥漫性星形细胞瘤中发现了基因编码的异柠檬酸脱氢酶（IDH1）的突变，目前已发现IDH1的突变是2-4级胶质瘤总体生存期和无进展生存期的一个主要的预后指标。

肿瘤的侵袭能力通常可通过癌细胞的高运动性和用于降低胞外基质的蛋白酶的表达量增加来预测。骨唾液蛋白（BSP）作为基质金属蛋白酶-2（MMP-2）的一个特异性的调控者，由IBSP基因编码，属于小型N端连接整合糖蛋白（SIBLING）基因家族一员。BSP在诸如前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌等多种癌症中都是高表达的，并可能有助于这些癌的侵袭潜能。一项早期的研究表明BSP对于临床局限的前列腺恶性腺癌在统计学上有显著的预后价值。类似的结果在非小细胞肺癌、乳腺癌、人类上皮癌、胰腺癌和骨肉瘤中都有发现。但在胶质瘤组织中尚未有BSP的表达及其预后价值的研究。

组织芯片(TMA)技术的发展，得益于生物芯片技术等的延伸。TMA具有高通量、快速、低误差、用途广泛等特点，目前主要应用在肿瘤病理学、实验室检测、药物研究等。利用组织芯片技术可以在细胞水平定位和蛋白水平检测相应靶标，从而实现基因及其表达产物与组织形态学研究以及临床数据相结合，同时还可以与原位杂交技术等相结合，因此TMA被广泛应用在肿瘤病理研究中,例如EMSY通路在乳癌及卵巢癌中的关系，AlphaB-Crystallin与乳癌的关系，TMPRSS2和ETS转移因子在前列腺癌的重要作用等。

TMA常见类型有演化TMA、预后TMA等。演化TMA指将某一肿瘤疾病发展的各个阶段的标本（诸如原发间变和继发胶母、原发胶母和复发胶母等）集中在一块TMA中，能在一张切片上同时看到肿瘤组织在原位、转移、复发等不同进展阶段的变化情况，可用以检测特定肿瘤在不同发展阶段的分子病理改变，有助于对肿瘤发生、发展及浸润转移等过程的研究。预后TMA是将带有可利用的临床随访数据的肿瘤标本集中在一张TMA中。使用预后TMA可以研究已知的分子靶标的改变或信号传导通路的变化对肿瘤患者预后的影响^[2]。TMA阵列中每个组织片段都对应于相应患者，因此利用TMA，结合临床数据和随访资料，可以对肿瘤患者进行大规模的回顾性数据分析，为疾病的早期诊断、早期治疗等提供指导。文献报道利用预后TMA发现Cyclooxygenase-2对鼻咽癌患者放疗预后有预测价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种利用高通量组织芯片检测BSP在脑胶质瘤中的表达的方法，该方法使得检测BSP的表达的灵敏性大大提高，能保证在极少的标本中获得足够的信息。

本发明的一种利用高通量组织芯片检测BSP在脑胶质瘤中的表达的方法，包括：

（1）使用Trizol试剂将脑组织进行总RNA的分离；

（2）对步骤（1）得到的总RNA进行反转录，得到cDNA；

（3）将上述cDNA与SYBR荧光染料混合并进行扩增；

（4）IBSP的表达通过抗GAPDH进行标准化，使用以下方程进行比较阈值循环法：表达折叠差异=2^{-(Δ目标基因的ct值-Δ参照ct值)}；

（5）构建组织芯片，然后进行免疫组化染色，对免疫组化结果进行统计分析，检测BSP在脑胶质瘤中的表达。

步骤（1）中所述的脑组织为胶质瘤或正常脑组织。

步骤（2）中所述的总RNA的质量为2ug，得到cDNA的质量为20ng。