[发明专利]成人睾丸支持细胞-胰岛复合物及其制备方法

权利要求书

1. 成人睾丸支持细胞-胰岛复合物的制备方法，其特征在于，包含如下步骤，

睾丸支持细胞的分离纯化：采用两步消化法分离纯化睾丸支持细胞；

成人胰岛的分离纯化：采用半自动灌注过滤法用1.5 g/L的胶原酶Ⅴ，消化胰腺，采用自动细胞淘洗仪（型号：Cobe2991），通过连续密度梯度离心的方法进行胰岛的纯化，分离和纯化的胰岛悬浮于含100 ml/L胎牛血清的RPMI-1640培养基，于37℃、50 ml/L CO₂ 培养箱中培养；

睾丸支持细胞-胰岛复合物的建立：首先将睾丸支持细胞消化，采用PKH-67对其进行标记；红色荧光细胞表面交联剂（PKH-26）标记的睾丸支持细胞与胰岛混合成细胞悬液0.5毫升，置于细胞细胞培养管培养2小时，随后转移肝素处理的低吸附培养皿中，加入含100 g/L 胎牛血清的RPMI1640培养基3 ml培养，使睾丸支持细胞附着于胰岛表面。

2. 如权利要求1所述的成人睾丸支持细胞-胰岛复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤睾丸支持细胞的分离纯化的两步消化法为，第一步2.5 g/L 胰蛋白酶、0.4 g/L DNA酶I，于37℃消化30min，第二步5 g/L 胶原酶Ⅴ、1 g/L 透明质酸酶37℃消化20min；将消化好的细胞接种于50ml的细胞培养瓶中，于39℃、5% CO₂培养箱中培养24小时，用20mmol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液（pH7.2）对细胞进行2.5 min的低渗处理，DMEM/F12培养基洗涤3次，最后采用含100 g/L FBS的RPMI1640的培养基于37℃、50 mL/L CO₂培养箱中培养。

3. 如权利要求1所述的成人睾丸支持细胞-胰岛复合物的制备方法，其特征在于，包含如下步骤，

睾丸支持细胞的分离纯化；用4℃的Hank’s液冲洗睾丸，去除被膜及血管，置于2.5 g/L 胰蛋白酶、0.4 g/L DNA酶I于37℃恒温水浴箱消化30 min，含100 mL/L胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，离心去上清，5 g/L 胶原酶Ⅴ、1 g/L 透明质酸酶于37℃恒温水浴箱中消化20 min，含100 mL/L 胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，100目的筛网过滤后，无血清DMEM/F12培养基洗涤3次后，离心去上清，所得的沉淀物均重悬于含200 mL/L胎牛血清的DMEM/F12培养基中, 于39℃、50 mL/L CO₂培养箱中孵育48小时，更换培养液, 于39℃、50 mL/L CO₂继续孵育8小时后, 更换无血清的培养液，20 mmol/L的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH 7. 0)对细胞进行5 min的低渗处理, 最后采用含100 g/L FBS的RPMI1640的培养基于37℃、50 mL/L CO₂培养箱中培养，隔天换液，在睾丸支持细胞培养过程中于倒置显微镜镜下观察计算细胞数量，取细胞制作细胞爬片，经波形蛋白免疫组化染色，通过观察波形蛋白表达鉴定睾丸支持细胞；

成人胰岛的分离纯化；成人胰腺采用冷凝系统将消化液降至4℃，以150 mLmin的流量连续灌注10 min，然后将采用热交换器，将管路温度上升至34℃，以150 ml/min的流量连续灌注5 min，灌注消化液配方：1.5 mg/L胶原酶NB1消化液含有共3.5万U的乌司他丁和2000 U的DNA酶I共350 ml；胰腺消化：将胰腺放入消化罐中，上下分别接硅胶管形成循环的环路，保持温度迅速提升并稳定在34℃，开始消化胰腺，自消化开始8min时，每min吸取1 ml消化系统中的液体，滴入DTZ染色于显微镜下观察胰岛游离的情况和腺泡松散的程度，且观察到50%的游离胰岛时，可终止消化；胰岛收集：迅速降低循环系统中消化液的温度，接取流出的消化液，以1L为一瓶，每一瓶添加不同量的稀释液和胎牛血清，接取的消化液也不相同，观察出口端流出的液体，待其变的清凉后，停止补充液体，将收集到的液体分装至无菌的250 ml离心管，并放至低温离心机中于4℃，140 g离心1 min，取出小心弃去上清液，再加入胰岛洗涤液后，轻微震荡均匀后在进行上述离心，反复洗涤三次；胰岛纯化：洗涤收集的胰岛组首先溶解在UW器官保存混匀放置30 min以上，将最终收集的组织离心后弃去上清，沉淀物分成20 ml的等份，每一份加入UW液，定容至200 ml，启动Cobe2991细胞淘洗仪，依次导入密度为1.100 的淋巴细胞分离液液130ml、130 ml，密度为1.070的淋巴细胞分离液130毫升、烧杯中导入胰岛/UW混合液，使其充分混匀，离心5 min，依次收集8瓶产物，弃去上清液，用冰洗涤液，4 ℃，280 g离心1 min，重复2遍，洗涤期间可根据取样检测结果，将纯度相近的离心管合并，分离纯化的胰岛大约每20000 胰岛当量（IEQ）的胰岛饲养于1个面积为175 cm²的细胞培养瓶，添加30 ml CMRL1066培养基，培养条件均为于37℃、5%的CO₂，每日全量更换培养基；胰岛观察：在胰岛培养过程中的吸出少量胰岛悬浊液置于培养皿中，经DTZ染色后，倒置显微镜镜下观察计算胰岛数量，经AO-PI染色经荧光显微镜下观察，计算胰岛活性；

睾丸支持细胞-胰岛复合物的建立：将培养的睾丸支持细胞用2.5 g/L胰酶（含0.2 g/L乙二胺四乙酸）消化，用含100 g/L小牛血清的DMEM/F12培养基终止消化收集2×10⁷睾丸支持细胞，PBS洗一遍，然后1000 r/min离心5 min，弃去上清液，加入1 ml PKH-67试剂盒中的缓冲液重悬细胞，另取1ml缓冲液稀释0.4 μl荧光标记液，1 ml细胞悬液与1 ml荧光标记液混合，吹打均匀，于25℃下颠倒混匀2-5min，加入小牛血清2 ml终止标记，混匀放置1 min，再加4 ml RPMI-1640培养基，混匀后1000 r/min离心10 min，更换离心管，10 ml培养液洗涤3次，每次10 min，最后将细胞悬液接种于培养瓶内培养，将分离纯化收集的1000 IEQ胰岛和5×10⁵的PKH-26标记睾丸支持细胞加入肝素处理的4 ml细胞培养管内，加入不超过0.5 ml RPMI1640培养基（含100 g/L FBS）中制成悬浊液，然后在37℃中共同孵育2 hr，孵育期间将胰岛与睾丸支持细胞轻轻混合一次，然后移至低吸附预处理的6孔板中，加入含100 g/L FBS的RPMI1640培养基3 ml继续培养，培养过程中经DTZ染色，于倒置像差显微镜下观察复合物构建情况，收集复合物经胰岛素-波形蛋白免疫组化双染，通过观察波胰岛素和形蛋白染色分布鉴定睾丸支持细胞是否附着于胰岛表面构成复合物。

4. 成人睾丸支持细胞-胰岛复合物，其特征在于，该复合物含有睾丸支持细胞，它与胰岛细胞共培养后，结合于胰岛细胞表面，与胰岛细胞形成复合物，该复合物的形态学特征是胰岛表面结合有大量多角形、有突起的睾丸支持细胞，该复合物既有分泌胰岛素的功能，同时具有分泌营养支持和免疫调节细胞因子的功能。