[发明专利]成人睾丸支持细胞-胰岛复合物及其制备方法

说明书

技术领域

本发明设计一种成人胰岛移植复合物的制备方法。

背景技术

胰岛移植已经成为最有希望治愈1型糖尿病的方法，供体短缺和移植物丢失限制了其广泛应用。

胰岛分离纯化过程中破坏了其内部的微循环系统，导致移植后无法像胰腺移植那样立即恢复血运，而是需要相当长时间重建血运系统，从而造成的营养缺乏损伤。此外，免疫排斥反应仍是困扰胰岛移植临床广泛开展的重要问题，采用具有免疫调节功能的细胞诱导胰岛移植的免疫耐受成为较理想的方法。

发明内容

睾丸支持细胞（Sertoli cells）同时具有营养支持和免疫调节功能。在改良成人胰岛分离纯化的基础上，采用睾丸支持细胞包被体外构建胰岛-睾丸支持细胞复合物，利用睾丸支持细胞营养支持作用，延长胰岛体外存活时间，同时利用其免疫调节功能，抑制排斥反应。从减轻胰岛缺血缺氧的时间和抑制排斥反应两个环节上减少胰岛移植物的丢失，提高其生存率。    

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

成人睾丸支持细胞-胰岛复合物的制备方法，其特征在于，包含如下步骤，

睾丸支持细胞的分离纯化：采用两步消化法分离纯化睾丸支持细胞；

成人胰岛的分离纯化：采用半自动灌注过滤法用1.5 g/L的胶原酶Ⅴ，本处可以参考李杨、薛武军、宋焕瑾等.成人睾丸支持细胞分离方法的建立及在胰岛移植中的应用.细胞与分析免疫学杂志，2010，26（6）：552-559；消化胰腺，采用自动细胞淘洗仪（型号：Cobe2991），通过连续密度梯度离心的方法进行胰岛的纯化，分离和纯化的胰岛悬浮于含100 ml/L胎牛血清的RPMI-1640培养基，于37℃、50 ml/L CO₂ 培养箱中培养；

睾丸支持细胞-胰岛复合物的建立：首先将睾丸支持细胞消化，采用PKH-67对其进行标记；红色荧光细胞表面交联剂（PKH-26）标记的睾丸支持细胞与胰岛混合成细胞悬液0.5毫升，置于细胞细胞培养管培养2小时，随后转移肝素处理的低吸附培养皿中，加入含100 g/L 胎牛血清的RPMI1640培养基3 ml培养，使睾丸支持细胞附着于胰岛表面。

本发明进一步技术方案在于在于，所述步骤睾丸支持细胞的分离纯化的两步消化法为，第一步2.5 g/L 胰蛋白酶、0.4 g/L DNA酶I，本处可以参考李杨、薛武军、宋焕瑾等.成人睾丸支持细胞分离方法的建立及在胰岛移植中的应用.细胞与分析免疫学杂志，2010，26（6）：552-559；于37℃消化30min，第二步5 g/L、1 g/L 透明质酸酶37℃消化20min；将消化好的细胞接种于50ml的细胞培养瓶中，于39℃、5% CO₂培养箱中培养24小时，用20mmol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液（pH7.2）对细胞进行2.5 min的低渗处理，DMEM/F12培养基洗涤3次，最后采用含100 g/L FBS的RPMI1640的培养基于37℃、50 mL/L CO₂培养箱中培养。

本发明进一步技术方案在于在于，包含如下步骤，

睾丸支持细胞的分离纯化；用4℃的Hank’s液冲洗睾丸，去除被膜及血管，置于2.5 g/L 胰蛋白酶、0.4 g/L DNA酶I于37℃恒温水浴箱消化30 min，含100 mL/L胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，离心去上清，5 g/L 胶原酶Ⅴ、1 g/L 透明质酸酶于37℃恒温水浴箱中消化20 min，含100 mL/L 胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，100目的筛网过滤后，无血清DMEM/F12培养基洗涤3次后，离心去上清，所得的沉淀物均重悬于含200 mL/L胎牛血清的DMEM/F12培养基中, 于39℃、50 mL/L CO₂培养箱中孵育48小时，更换培养液, 于39℃、50 mL/L CO₂继续孵育8小时后, 更换无血清的培养液，20 mmol/L的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH 7. 0)对细胞进行5 min的低渗处理, 最后采用含100 g/L FBS的RPMI1640的培养基于37℃、50 mL/L CO₂培养箱中培养，隔天换液，在睾丸支持细胞培养过程中于倒置显微镜镜下观察计算细胞数量，取细胞制作细胞爬片，经波形蛋白免疫组化染色，通过观察波形蛋白表达鉴定睾丸支持细胞；