[发明专利]一种新发鸭坦布苏病毒RT-LAMP检测方法

说明书

技术领域：

本发明涉及的是生物技术领域，具体的是一种新发RNA病毒的检测方法。

背景技术：

鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus，DTMUV)是2010年在中国大陆新发生的主要针对产蛋鸭和雏鸭的一种新的疫病。临床上主要侵害脑、卵巢、肝脏、心脏等实质器官，以出现脑炎、瘫痪等神经症状和产蛋下降为主要危害特征。

鸭坦布苏病毒的基因组为不分节段的具有感染性的单股正链RNA，由10 990 个核苷酸(nt)组成。基因组由5'端和3'端非编码区(UTR)及一个开放阅读框(ORF)组成，基因组的顺序为5'-UTR-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3- NS4ANS4B-NS5-UTR-3'。结构蛋白编码位于基因组5'端，非结构蛋白编码区位于3'端。5'端UTR长为142 nt，有一个I型m7GpppNp帽子结构。3'端UTR长618 nt，无poly(A) 结构。UTR是黄病毒基因组复制起始调控位点，影响病毒的复制、翻译及其致病性。鸭坦布苏病毒的5'端、3'端UTR与Bagaza病毒的5'端、3'端UTR 同源性分别为76.3%和77.4%。多数黄病毒的3'端UTR 含有长度约为20nt的保守序列。鸭坦布苏病毒的3'端UTR含有3个保守序列(CS1、CS2、CS3)，长度分别为25nt、23nt和28nt，其中CS2和CS3为串联重复序列(RCS)，从5'→3' 依次为RCS3-CS3-RCS2-CS2-CS1。CS的组成形式是区分黄病毒属由哪种传播媒介传播的重要依据，蚊传播的黄病毒常含有CS1。 

目前，鸭坦布苏病毒检测主要依赖病毒分离和分子生物学检测。 

病毒分离是鸭坦布苏病毒的传统检测方法。病鸭的卵泡膜、脑、脾脏、肝脏等病变组织适宜分离病毒，卵泡膜中最易分离和检测到病毒。鸭坦布苏病毒在鸭胚、鸡胚、鸭胚成纤维细胞及Vero细胞中初次分离的成功率仅为20.6%，低于临床样品RT-PCR 检出率。初次病毒分离阴性时继续盲传3代。 

鸭坦布苏病毒的分子生物学检测方法有RT-PCR、套式RT-PCR、荧光定量RT-PCR等。Maher-Sturgess等根据报道的257个黄病毒的NS5基因中编码甲基转移酶和聚合酶基因的核苷酸序列设计了一对可检测所有黄病毒成员的通用兼并RT-PCR 引物，上游引物为AAYTCIACICAIGARATGTAY，下游引物为CCIARCCACATRWACCA，扩增片段大小为800 bp。胡旭东等、万春和等和Cao 等分别根据E、NS3 基因保守序列，设计引物，建立了可直接检测感染鸭组织中鸭坦布苏病毒的特异、敏感的RT-PCR 检测方法。颜丕熙等建立的套式RT-PCR 方法，灵敏度比常规PCR高10倍，临床样品阳性检出率高于病毒分离率。Yan 等建立了TaqMan 探针荧光定量PCR 方法，灵敏度是常规PCR的100倍。Tang 

黄病毒的血清学检测方法有ELISA、琼扩试验、血凝抑制试验、补体结合试验和中和实验等。姬希文等以纯化的FX2010株作为包被抗原，建立了检测鸭坦布苏病毒血清抗体的间接ELISA法，敏感性和特异性较高，阴阳性临界值判定标准为0.432。

但到目前为止还没有确定一种最具有临床使用价值的基层分子生物学诊断方法。 

反转录-环介导等温扩增(Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP)技术是一种等温核酸扩增新技术，其特点是针对靶基因的6个区域设计3对特异引物，利用一种链置换DNA 聚合酶在等温条件(63 ℃左右) 保温30～60分钟，即可完成核酸扩增反应。与常规PCR相比，该方法不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，由于不依赖任何专门的仪器设备可实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR，目前这一技术已经被用于多种病原微生物的检测。 

LAMP技术具有一下特征： 

1.引物设计

针对靶基因6个特异序列(3’端的F3c、F2c和Flc区以及5’端的Bl、B2

和B3区)设计4条引物：上游内部引物(FIP)、上游外部引物(F3)、下游内部引物(BIP)、下游外部引物(B3)。后来添加了2条环状引物，上游环状引物(LF)和下游环状引物(LB)。国外已建立了LAMP引物设计的在线网站(http://primerexplorer.jp/e/)，只要导入靶基因就能自动生成成组引物。挑选最优组合即可。