[发明专利]人β-NGF的重组表达载体及含该载体的重组细胞株

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种重组人β-NGF的分泌型 表达载体以及含该载体的重组细胞株。

背景技术

神经生长因子(NGF)是神经营养因子中最早被发现、目前研究最 为透彻的一种神经细胞生长调节因子，具有神经元营养和促突起生长 双重生物学功能，它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生 和功能特性的表达均具有重要的调控作用。NGF在人体内主要分布于 脑、神经节、虹膜、心脏、脾、胎盘等组织及成纤维细胞、平滑肌、 骨骼肌、胶质细胞、雪旺氏细胞等。NGF与受体结合，通过受体介导 的内吞机制产生内在化，形成由轴膜包绕、含有NGF、并保持其生物 活性的小泡，经轴突沿微管逆行转运至胞体，经醋氨酸蛋白激酶、脂 眈肌醇钙、内源性环腺昔酸等第二信使体系的转导，启动一系列级联 反应，对靶细胞的某些结构或功能蛋白基因表达进行调控而发挥其生 物效应。大鼠体内试验结果表明：NGF可改善由己二酮和丙烯胺造成 的大鼠中毒性周围神经病所致的肢体运动功能障碍，缩短神经-肌肉动 作电位潜伏期，并提高神经-肌肉动作电位幅度。组织病理学检查结果 表明，NGF有减轻动物胫神经的髓鞘肿胀发生率和降低变性胫神经纤 维数量等作用。以上结果提示：NGF有促进神经损伤修复的作用。

NGF包含α、β、γ三个亚基，活性区是β亚基，由两个118个氨 基酸组成的单链通过非共价键结合而成的二聚体。NGFβ亚基（简称 β-NGF）具有完整的NGF生物学活性，是与BDNF，NT-3和NT-4结 构相关的神经营养因子，为含有半胱氨酸结（cysteineknot）的稳定二 聚体结构家族。β-NGF是一种强效的神经营养因子，通过其受体 β-NGFR进行信号传递，在外周神经中知觉神经元和交感神经系统的 发育中起到重要的作用。β-NGF还在B淋巴细胞中起到生长和分化因 子的作用，可以增强B细胞的存活能力，抑制中性粒细胞的凋亡。上 述研究结果提示，β-NGF是一种多功能的细胞因子，不仅在神经系统 发育中起重要作用，在免疫调节中可能也具有重要的作用。

目前生产β-NGF的方法主要有两种：一种是从小鼠颌下腺提取的 分子量约为13-14KD，沉降系数为2.5S的β-NGF，此种方式所获得的 β-NGF具有如下缺点：（1）鼠NGF与人NGF在蛋白序列上有10%的 差异，使其具有免疫原性，可能诱发抗体反应，从而降低药效；（2） 具有鼠源病毒交叉感染的安全隐患；（3）生产依赖活体动物。另一种 是由原核表达系统（E.coli）重组表达制备，此种方式的缺陷是，蛋白 不能进行翻译后修饰，所得β-NGF活性明显低于天然β-NGF。因此， 开发一种可稳定、高效表达天然活性β-NGF的表达系统具有重要的临 床及商业价值。

发明内容

本发明要解决的技术问题为提供一种可稳定、高效表达天然活性 β-NGF的重组表达载体，基于该重组表达载体的重组真核细胞株，以 及基于该重组真核细胞株的生产人β-NGF的方法。

具体地，本发明提供了一种表达人β-NGF（即人神经生长因子β 亚基）的重组表达载体，依次包含以下可操作性相连的元件：启动子、 β球蛋白基因内含子、人β-NGF基因、内部核糖体进入位点序列和筛 选标记基因；所述β球蛋白基因内含子序列如SEQ ID No.1所示，人 β-NGF基因序列如SEQ ID No.2所示，内部核糖体进入位点序列如 SEQ ID No.3所示。

上述重组表达载体中，所述启动子驱动人β-NGF基因和筛选标记 基因的共表达；所述β球蛋白基因内含子，简称BGI，可增强人β-NGF 基因的转录效率，还可促进mRNA从细胞核转移到内质网；所述内部 核糖体进入位点，简称IRES，可招募核糖体对mRNA进行翻译，因 此可调控其下游筛选标记基因的表达。

优选地，所述启动子为CMV启动子、PGK启动子、RSV启动子 或SV40启动子中的任意一种。

所述筛选标记基因为二氢叶酸还原酶基因、谷氨酰胺合成酶基 因、新霉素抗性基因、博来霉素抗性基因、潮霉素抗性基因或多色霉 素抗性基因中的任意一种。

上述重组表达载体适用的起始构建载体不限，如在哺乳动物细胞 中表达用的疫苗病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体或腺伴病毒 载体。