[发明专利]一种海胆黄多糖荧光结合物及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种海胆黄多糖荧光结合物及其制备方法和应用，属于生物医药领域。

背景技术

糖生物学是当前生命科学研究的一大热点，香菇多糖、裂褶菌多糖、人参多糖等已作为免疫增强剂和抗肿瘤辅助药物在临床上应用，效果显著。除具广谱的免疫调节和抗肿瘤活性外，多糖还具有降胆固醇、降血糖、抗病毒等生物活性。海胆黄多糖是刘纯慧等（参见中国海洋药物，2006）首次从海胆黄（卵）中分离得到的一种结构新颖的葡聚糖，其重均分子量1.95×10⁶，重复单元的结构式如下：

海胆黄多糖体内具有显著的抗肿瘤和免疫调节作用，是一种有研究和开发价值的海洋新型候选药物。但是多糖结构复杂多样，尤其是其作为多羟基醛的聚合物，缺乏生色基团，难以进行微量定量分析检测，制约了活性多糖的进一步研究与开发。因此，如果在保持其生物活性的基础上，对海胆黄多糖的结构加以改造使其携带紫外基团或荧光基团，便于海胆黄多糖的分析检测，从而推动海胆黄多糖的开发进程。尽管康迪等报道（参见药物生物技术，2012）利用海胆黄多糖还原末端半缩醛通过引入酪胺可间接与荧光素结合，但由于海胆黄多糖分子量高达近200万（即每个多糖分子平均由1万个以上的葡萄糖残基形成的长链化合物），每个分子只有一个还原末端，在如此长的一个多糖分子末端加一分子荧光素，反应效率及分辨率等均无保证。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种海胆黄多糖荧光结合物，本发明还供该结合物的制备方法和应用。

本发明的技术方案如下：

一种海胆黄多糖荧光结合物，是海胆黄多糖分子中葡萄糖残基上的羟基与异硫氰酸荧光素共价结合，多糖分子中葡萄糖残基修饰率为0.1%～10%，即每10～1000个葡萄糖残基结合1分子的异硫氰酸荧光素。

优选的，海胆黄多糖荧光结合物中多糖分子中葡萄糖残基修饰率为0.5%～1.0%，即每100～200个葡萄糖残基结合1分子的异硫氰酸荧光素。

一种海胆黄多糖荧光结合物的制备方法，包括以下步骤：

（1）将海胆黄多糖无水情况下溶解于二甲基亚砜中，加入异硫氰酸荧光素，使海胆黄多糖与异硫氰酸荧光素质量比为50∶1～5∶1或海胆黄多糖分子葡萄糖残基与异硫氰酸荧光素摩尔比为120∶1～12∶1，然后按每10ml反应体系分别加入吡啶50～1500μl和二丁基锡二月桂酸1～1000μl，避光于60℃～95℃下反应1h～8h；

（2）反应结束后，冷却至室温，加入4～6倍体积的无水乙醇醇沉，离心收集沉淀并真空干燥，层析纯化，然后冷冻干燥得海胆黄多糖荧光结合物。

步骤（1）中所述的海胆黄多糖可按照现有技术制得，可参照文献（刘纯慧等，中国海洋药物，2006(3)：7-11）制备。具体方法如下：

取新鲜的海胆黄，丙酮脱脂后加水在90°C提取，木瓜蛋白酶-Sevag法组合去蛋白，4倍量乙醇沉淀，真空干燥得多糖粗品。粗品经DEAE SepharoseFast Flow离子交换、Sephacryl S-400分子筛柱层析分离纯化，透析或超滤脱盐后冷冻干燥得白色絮状固体即为海胆黄多糖。高效液相色谱法确定其为均一组分；高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)确定其相对分子质量为1.95×106。

优选的，

步骤（1）中所述的海胆黄多糖与异硫氰酸荧光素质量比为25∶1～8∶1或海胆黄多糖分子葡萄糖残基与异硫氰酸荧光素摩尔比为60∶1～20∶1。

步骤（1）中所述的吡啶按每10ml反应体系加入100-500μl，即终浓度为1%～5%（v/v）。

步骤（1）中所述的二丁基锡二月桂酸按每10ml反应体系加入5-100μl，即终浓度为0.05%～1%（v/v）。

步骤（2）中所述的层析纯化采用的方法为超滤或凝胶过滤柱层析纯化。

步骤（2）中所述的无水乙醇加入量为5倍体积。

步骤（2）中所述的醇沉温度为4℃，时间为12h。

本发明一种海胆黄多糖荧光结合物的制备方法，优选的制备步骤如下：

（1）将100mg海胆黄多糖无水情况下溶解于10ml二甲基亚砜中，加入10.0mg异硫氰酸荧光素，然后加入吡啶200μl、二丁基锡二月桂酸5μl，避光于90℃下反应2h；

（2）反应结束后，冷却至室温，加入5倍体积的无水乙醇于4℃静置12h，离心收集沉淀并真空干燥，凝胶过滤柱层析纯化，然后冷冻干燥得海胆黄多糖荧光结合物。