[发明专利]一种A型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测方法及其试剂盒和应用

权利要求书

1.一种A型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）储备A型口蹄疫标准对照抗原；

2）纯化定量A型口蹄疫标准对照抗原146S；

3）建立A型口蹄疫间接夹心ELISA方法；

4）绘制标准对照抗原标准曲线；

5）计算被检样品146S 抗原含量；

6）检测敏感性和特异性。

2.根据权利要求1所述的一种A型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测方法，其特征在于，所述步骤1）中，对A型口蹄疫标准对照抗原，一部分按5mL/瓶，置于-70℃储备，此部分仅解冻一次，用于ELISA试验；另一部分按3×100 mL，置于-70℃储备，此部分仅解冻一次，分三次用于146S抗原纯化定量。

3.根据权利要求2所述的一种A型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测方法，其特征在于，所述步骤2）中，是利用蔗糖密度梯度法，梯度浓度为45%、35%、25%、15%，纯化A型口蹄疫标准对照抗原，三次测得146S抗原含量的平均值为1.74μg/ml。

4.根据权利要求3所述的一种A型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测方法，其特征在于，所述步骤3）中，建立A型口蹄疫间接夹心ELISA方法的过程具体如下：

a）包被ELISA板：用pH 9.6的碳酸盐包被缓冲液稀释口蹄疫A型兔抗血清至工作浓度，工作浓度为1:1000，即将1μl口蹄疫A型兔抗血清加入1000μl碳酸盐包被缓冲液中，混匀，每孔加50μl于底部，震荡2-3分钟后用封板膜封板或置湿盒中室温过夜；

b）洗涤ELISA板：揭掉封板膜，弃去ELISA板中液体，每孔加满洗涤液，洗涤液为0.01M， pH 7.4的磷酸盐吐温缓冲液，1×PBST，静置30秒后弃去液体，重复4次，拍干；

c）加样：用1×PBST将对照抗原和被检抗原从1:2，即50μl抗原加50μl PBST，开始做2倍连续稀释至1:256，每孔加50μl，37℃，温育1小时，用PBST洗涤ELISA板4次，拍干；

d）加二抗：用豚鼠抗血清稀释液稀释口蹄疫A型豚鼠抗血清至工作浓度，工作浓度为1:1000，即将1μl口蹄疫A型豚鼠抗血清加入1000μl豚鼠抗血清稀释液中，豚鼠抗血清稀释液为含10%正常牛血清，5%健康兔血清的PBST，每孔加50μl，封板，37℃，温育1小时后用PBST洗涤ELISA板4次，拍干；

e）加酶：用1×PBST稀释兔抗豚鼠-辣根过氧化物酶结合物至工作浓度，工作浓度为1:500，即将1μl兔抗豚鼠-辣根过氧化物酶结合物加入1000μl PBST中，每孔加50μl，37℃温育1小时后用PBST洗涤ELISA板4次，拍干；

f）显色：每孔加50μl底物溶液，37℃温育15分钟，所述底物溶液为20mmol/L邻苯二胺OPD，0.05M柠檬酸磷酸盐缓冲液，0.015%H₂O₂；

g）终止：每孔再加50μl 终止液终止反应，所述终止溶液为浓度为1.25%的H₂SO₄；

h）测定：在490nm 波长下读取光吸收值。

5.根据权利要求4所述的一种A型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测方法，其特征在于，所述步骤4）中，是以标准对照抗原的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。

6.根据权利要求5所述的一种A型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测方法，其特征在于，所述步骤5）中，是以样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数，得到样品的实际浓度；

或以标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，得到样品的实际浓度。

7.根据权利要求6所述的一种A型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测方法，其特征在于，所述步骤6）中，是将A型口蹄疫146S抗原作系列稀释，用标准对照抗原的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式的最小抗原含量，将待测口蹄疫抗原作为被检抗原时，检测反应OD值小于标准对照抗原的敏感性检测值。