[发明专利]一种A型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测方法及其试剂盒和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种A型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测方法及其试剂盒和应用。

背景技术

口蹄疫（foot and mouth disease, FMD）是猪、牛、羊等主要家畜和其它偶蹄动物共患的一种急性、热性、高度接触性传染病，易感动物达70多种。临床特征是在口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱性疹。该病传播途径多、速度快，曾多次在世界范围内暴发流行，造成巨大政治、经济损失。世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须申报的传染病，我国也将其列为一类动物传染病之首。

口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus, FMDV)属于微核糖核酸病毒科口蹄疫病毒属，有七个血清型：O型、A型、亚洲Ⅰ型、C型以及南非1、2、3型。各血清型之间没有交叉保护。现阶段我国主要流行O型、A型和亚洲Ⅰ型。

疫苗接种是预防、控制口蹄疫的有效手段之一。在我国，口蹄疫灭活疫苗使用最为广泛；为确保它安全有效，对其质量进行严格的控制极为必要。目前，国际上通用的疫苗效力检测方法是本动物攻毒保护试验，或采用PD₅₀测定法（欧洲）：即用疫苗50%动物保护剂量( PD₅₀)来评价疫苗免疫效果，常规疫苗需至少达到3个PD₅₀，紧急接种疫苗需至少达到6个PD₅₀；或采用（PGP）测定法（南美）：即用疫苗保护百分率（PGP）来评价疫苗免疫效果，PGP达到75%以上，该疫苗合格，PGP为62.5%～68.8%，需要进行重复检验，PGP小于62%，该疫苗不合格。本动物攻毒保护试验的动物必须是来自无口蹄疫地区、无口蹄疫病毒中和抗体的非疫苗免疫本动物。由于我国采取强制免疫手段控制口蹄疫的流行和暴发，所以筛选试验动物相当困难；另外，这种方法的成本高、周期长、重复性较差，且需要高安全动物舍，不易操作。

为此，研究者开展了多种检验方法的研究，尝试替代本动物攻毒保护试验。这些研究主要分为三类：血清学替代法、试验动物替代法和疫苗抗原定量法。

口蹄疫血清学效力检测替代方法是通过检测疫苗免疫后的抗体滴度水平来评价疫苗免疫效力，主要包括病毒中和试验和液相阻断ELISA试验。1968年，Stellman等提出了用中和抗体滴度分析疫苗效力的统计学方法；到1976年，Pay等根据中和抗体滴度和疫苗效力的关系建立了疫苗的抗原剂量、中和抗体滴度和保护率的相关公式。马军武等通过液相阻断ELISA检测疫苗免疫抗体与攻毒保护分析确定了牛、羊、猪等口蹄疫免疫抗体与攻毒保护的关系。疫苗免疫血清抗体效价检测须用非口蹄疫疫苗免疫动物，无法从根本上取代本动物的使用，动物的选择仍存在困难。

试验动物替代法是用试验动物（如小鼠、豚鼠等）代替本动物，进行疫苗效力检验。研究发现，用豚鼠进行牛口蹄疫灭活疫苗的效力试验，与本动物效力检验的 PD₅₀之间有较好的相关性 (Eissner等1976; Terpstra等1976)， 也可用小鼠或BALB/c小鼠替代牛间接评价了口蹄疫灭活疫苗的效力（Sutmoller等 1980；DusSantos等2000）。替代性试验动物适合规模养殖，均一性容易控制，试验动物与本动物攻毒后的PD₅₀呈一定的正相关关系，但替代性试验动物的与本动物的免疫反应有一定差别，而且替代性试验动物人工感染病毒时使用的是试验株，与天然感染在株系和感染途经上存在区别。

口蹄疫病毒在蔗糖密度梯度离心时，根据沉降系数不同，可以分为完整病毒粒子（146S或140S）、空衣壳（76S）、病毒感染相关肽（45S）、12 S蛋白亚单位（12S）。研究发现，完整病毒粒子（146S或140S）是口蹄疫灭活疫苗中诱导动物机体产生保护性免疫应答的主要成分，因此疫苗中完整病毒粒子含量与疫苗的免疫保护效力具有明显相关性。FMD疫苗抗原定量的各种方法也是据此研发的，主要包括蔗糖密度梯度离心法、单抗夹心ELISA法和尺寸排阻层析法。

1971年，Fayet等建立了用紫外光定量检测蔗糖梯度中口蹄疫完整病毒粒子（146S或140S）的方法；随后，Barteling and Meloen（1974）和Doel等对其进一步完善，并于1982年向OIE正式推荐。在此后的三十多年中，该方法一直作为口蹄疫疫苗抗原定量的经典方法被世界各国的口蹄疫疫苗研究者和供应商广泛使用。但这种方法也有其缺点：操作复杂、仪器昂贵、重复性较差、不适合大量样品检测，还不能区分血清型。