[发明专利]可同时检测副溶血弧菌、创伤弧菌和溶藻弧菌的多重PCR检测方法

权利要求书

1.一种可同时检测副溶血弧菌、创伤弧菌和溶藻弧菌的多重PCR检测方法，其特征在于依次按如下步骤进行：

a. 制备被检测物的DNA模板并置于反应管中；

b. 将副溶血弧菌、溶藻弧菌和创伤弧菌引物放入a步骤的反应管中进行多重PCR 反应，所述副溶血弧菌引物浓度为1~20 pmol/μl，所述创伤弧菌引物浓度为1~20 pmol/μl，所述溶藻弧菌引物浓度为1~30 pmol/μl；

所述副溶血弧菌的引物序列为：

flaE-F:5’- GCAGCTGATCAAAACGTTGAGT-3’

flaE-R: 5’-ATTATCGATCGTGCCACTCAC-3’

所述创伤弧菌的引物序列为：

 vvh-F: 5’-TTCCAACTTCAAACCGAACTATGAC-3’

 vvh-R: 5’-ATTCCAGTCGATGCGAATACGTTG-3’

所述溶藻弧菌的引物序列为：

 col-F：5’-CGAGTACAGTCACTTGAAAGCC-3’

col-R：5’-CACAACAGAACTCGCGTTACC-3’

所述多重PCR 反应条件为：94℃预变性3min；94℃ 30s，52.0-61℃ 30s，72℃ 1min，共32个循环；72℃终延伸7min；

 所述多重PCR反应体系为25μl：1μlDNA模板，2.5μl不含Mg²⁺的10×PCR buffer，0.5μl的10mM的dNTP，2μl的25mM的Mg²⁺，0.15μl的Taq酶（50U），引物各1μl，双蒸水17.85μl。

2.根据权利要求1所述的可同时检测副溶血弧菌、创伤弧菌和溶藻弧菌的多重PCR检测方法，其特征在于：所述a步骤的制备被检测物的DNA模板是取水产动物的组织匀浆液置于1.5ml的离心管中，800g离心5min，除去组织碎片取上清置于1.5ml灭菌离心管中；10，000g离心10min，除去上清液，加入100μl 0.1 M 的TE缓冲溶液，100℃沸水浴10min； 10，000g离心10min，上清液即水产动物DNA模板。