[发明专利]可同时检测副溶血弧菌、创伤弧菌和溶藻弧菌的多重PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种多重PCR检测方法，尤其是一种耗时短、效率高、灵敏度高，可直接应用于临床的可同时检测副溶血弧菌、创伤弧菌和溶藻弧菌的多重PCR检测方法。

背景技术

弧菌广泛分布于近岸、河口海区，大多是存在于海水和海洋生物体表及肠道的优势菌群，同时也是引起海水养殖动物细菌性疾病的最重要的病原菌之一。大量的研究和生产实践表明，弧菌病就是由弧菌属细菌引起的一类细菌性疾病，流行广、发病率高，主要的病原弧菌有：溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)等10多种弧菌。

溶藻弧菌可导致对虾败血症；导致黑鲷表皮溃疡、出血、有黑斑，眼球突出、充血，腹部肿胀，肝脏充血，肾脏苍白，脾脏肿大等；导致点带石斑鱼体表有溃疡，鳃、鳍等充血，腹腔积液，肝严重肿大，肾、脾等脏器毛细血管充血等。溶藻弧菌感染的宿主范围还十分广泛，可以通过生食被感染的贝类、鱼类等传染给人类，是沿海地区食物中毒和腹泻的重要病原菌，食物中毒患者可出现腹泻、腹部痉挛、恶心、呕吐、发热，甚至脱水、昏迷等症状。

创伤弧菌可感染黄姑鱼、青石斑、鲑点石斑、红鳍笛鲷、鳗鲡等养殖动物，主要症状为患病鱼体表有出血点甚至溃烂，各鳍基部充血、出血、发炎。创伤弧菌也是引起人畜共患病的重要病原菌，该病主要引起原发性败血症和严重的创伤口感染，也可以导致坏死性肠胃炎、脑膜炎、肺炎、角膜炎等病，死亡率超过50%。

副溶血弧菌可引起凡纳滨对虾幼虾（体长2~3cm）发生毁灭性死亡，主要症状为运动能力差，摄食能力下降，身体弯曲，体表和附肢上常有大量污物附着，肌肉浑浊、鳃部呈黑色等症状；感染红鳍笛鲷引起的溃疡病、传染性强，患病红鳍笛鲷的症状表现为：体色变浅，胸鳍、尾鳍、腹鳍溃烂，体表溃疡且黏液增多，溃疡周围的鳞片大面积脱落。

目前，多重PCR主要应用于可引起人类疾病的弧菌检测，如食品检测等，而在水产动物弧菌病基本上都是沿用普通PCR方法，一次只能检测一种弧菌，检测所需时间长且常常造成漏检或误检。

本发明是为了解决现有技术所存在的PCR方法检测水产动物弧菌病致病菌，一次只能检测一种弧菌，检测所需时间长，且常常造成漏检现象的问题，提供一种可以同时检测多种弧菌病致病菌检测的多重PCR方法。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在上述问题，提供一种耗时短、效率高、灵敏度高，可直接应用于临床的可同时检测副溶血弧菌、创伤弧菌和溶藻弧菌的多重PCR检测方法。

本发明的技术解决方案是：一种可同时检测副溶血弧菌、创伤弧菌和溶藻弧菌的多重PCR检测方法，其特征在于依次按如下步骤进行：

a. 制备被检测物的DNA模板并置于反应管中；

b. 将副溶血弧菌、溶藻弧菌和创伤弧菌引物放入a步骤的反应管中进行多重PCR 反应，所述副溶血弧菌引物浓度为1~20 pmol/μl，所述创伤弧菌引物浓度为1~20 pmol/μl，所述溶藻弧菌引物浓度为1~30 pmol/μl；

所述副溶血弧菌的引物序列为：

flaE-F:5’- GCAGCTGATCAAAACGTTGAGT-3’

flaE-R: 5’-ATTATCGATCGTGCCACTCAC-3’

所述创伤弧菌的引物序列为：

 vvh-F: 5’-TTCCAACTTCAAACCGAACTATGAC-3’

 vvh-R: 5’-ATTCCAGTCGATGCGAATACGTTG-3’

所述溶藻弧菌的引物序列为：

 col-F：5’-CGAGTACAGTCACTTGAAAGCC-3’

 col-R：5’-CACAACAGAACTCGCGTTACC-3’

 所述多重PCR 反应条件为：94℃预变性3min；94℃ 30s，52.0-61℃ 30s，72℃ 1min，共32个循环；72℃终延伸7min；

 所述多重PCR反应体系为25μl：1μlDNA模板，2.5μl不含Mg²⁺的10×PCR buffer，0.5μl的10mM的dNTP，2μl的25mM的Mg²⁺，0.15μl的Taq酶（50U），引物各1μl，双蒸水17.85μl。