[发明专利]一种山羊前体脂肪细胞体外培养的方法

权利要求书

1.一种山羊前体脂肪细胞体外培养的方法，其特征在于基于传统消化培养方法，选取山羊前体肋间脂肪组织，利用改良过的胶原酶I培养基处理脂肪组织，采用改良的含胎牛血清的DMEM低糖培养液对山羊前体脂肪细胞进行体外培养，获得山羊前体脂肪细胞；其具体工艺步骤为：

（1）、胶原酶I培养基的制备：将100mg胶原酶I、3g牛血清白蛋白和1ml青链霉素溶液溶解于50mlHBSS溶液中，调节其溶液的PH值为7.2～7.4，经过0.22微米过滤器过滤和分装，配制成重量百分比浓度为0.2％的胶原酶I培养基，在-20℃温度条件下保存备用；

（2）、细胞培养液的制备：在DMEM低糖培养液中添加其体积15％的胎牛血清、2%的非必需氨基酸、1%L-谷氨酰胺、1%青链霉素溶液和20ng/ml的小鼠表皮生长因子,经0.22微米过滤器过滤和分装后，配制成细胞培养液，在4℃温度条件下保存备用；

（3）、脂肪组织的取样与前处理：将山羊从颈部放血并处死后，在无菌条件下取出山羊前体肋间脂肪组织，将其迅速放入酒精中浸泡2-10秒，用无菌生理盐水反复冲洗后将其移入含重量百分比浓度为1%青链霉素溶液的灭菌PBS缓冲液中并置入无菌室，用无菌PBS漂洗3～5次，并用眼科剪去除脂肪组织中可见的血管和结缔组织，得到脂肪组织样品；

（4）、山羊前体脂肪细胞的分离与体外培养：用无菌眼科剪将已处理过的脂肪组织样品快速地剪切成0.5~1mm³小块，移入15ml离心管中，再加入2-3倍脂肪组织样品体积的0.2％的胶原酶I培养基混合均匀，在37℃恒温摇床中消化75-85min，其间每10min振荡1次，加入等体积细胞培养液终止消化；然后分别用80目、150目和300目不锈钢细胞筛过滤去除未消化的组织块及大体积的脂肪细胞，将消化后的细胞培养液移入离心管，在2000r/min转速条件下离心6-10min；除去离心后的上清液后加入细胞培养液清洗1次，在2000r/min转速条件下离心5min后制成细胞悬液并在显微镜下计数，以5×104cells/mL接种细胞至60mm培养皿，置入温度为37℃、饱和湿度、体积比为5％的CO₂的培养箱中培养，每2天更换一次培养液，实现山羊前体脂肪细胞的体外培养。