[发明专利]一种山羊前体脂肪细胞体外培养的方法

说明书

技术领域：

本发明属于细胞培养工程技术领域，涉及一种山羊前体脂肪细胞体外培养的方法。

背景技术：

前体脂肪细胞是脂肪细胞的一种，由多能干细胞(multi-potential stem cell，MSC)或胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)分化而来，细胞体积小，呈梭形，间质少，胞浆内不含脂滴，但具有向胞浆内聚集脂滴的能力，在体内和体外都可以分裂增殖，并在胞浆内聚集脂滴而分化为成熟的脂肪细胞。目前，培养成功的前体脂肪细胞主要来源于人、鼠和猪，近年来，国内一些实验室也陆续对山羊前体脂肪细胞展开了研究，现在所用的培养方法主要有组织块培养法和消化培养法；组织块培养法需要时间长人力多，细胞大约在10~12天达到单层融合；消化培养法较组织块培养法所需时间缩短，细胞生长融合时间也需7~8天，且细胞在多次传代后出现老化，增殖减慢至死亡现象。因此，提供一种简单高效，节省时间，维持细胞活力的山羊前体脂肪细胞体外培养方法很有应用前景。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，寻求设计提供一种简单高效，节省时间，维持细胞活力的山羊前体脂肪细胞体外培养方法，对现有的消化培养方法进行改良，使细胞消化和原代细胞贴壁数目增多；通过改良培养液的组成，使细胞衰老死亡现象明显减弱。

为了实现上述目的，本发明基于传统消化培养方法，选取山羊前体肋间脂肪组织，利用改良过的胶原酶I培养基处理脂肪组织，采用改良的含胎牛血清的DMEM低糖培养液对山羊前体脂肪细胞进行体外培养，获得山羊前体脂肪细胞；其具体工艺步骤为：

（1）、胶原酶I培养基的制备：将100mg胶原酶I、3g牛血清白蛋白和1ml青链霉素溶液（PS）溶解于50mlHBSS溶液中，调节其溶液的PH值为7.2～7.4，经过0.22微米过滤器过滤和分装，配制成重量百分比浓度为0.2％的胶原酶I培养基，在-20℃温度条件下保存备用；

（2）、细胞培养液的制备：在DMEM低糖培养液中添加其体积15％的胎牛血清、2%的非必需氨基酸（NEAA）、1%L-谷氨酰胺、1%青链霉素溶液（PS）和20ng/ml的小鼠表皮生长因子（EGF）,经0.22微米过滤器过滤和分装后，配制成细胞培养液，在4℃温度条件下保存备用；

（3）、脂肪组织的取样与前处理：将山羊从颈部放血并处死后，在无菌条件下取出山羊前体肋间脂肪组织，将其迅速放入酒精中浸泡2-10秒，用无菌生理盐水反复冲洗后将其移入含重量百分比浓度为1%青链霉素溶液（PS）的灭菌PBS缓冲液中并置入无菌室，用无菌PBS漂洗3～5次，并用眼科剪去除脂肪组织中可见的血管和结缔组织，得到脂肪组织样品；

（4）、山羊前体脂肪细胞的分离与体外培养：用无菌眼科剪将已处理过的脂肪组织样品快速地剪切成0.5~1mm³小块，移入15ml离心管中，再加入2-3倍脂肪组织样品体积的0.2％的胶原酶I培养基混合均匀，在37℃恒温摇床中消化75-85min，其间每10min振荡1次，加入等体积细胞培养液终止消化；然后分别用80目、150目和300目不锈钢细胞筛过滤去除未消化的组织块及大体积的脂肪细胞，将消化后的细胞培养液移入离心管，在2000r/min转速条件下离心6-10min；除去离心后的上清液后加入细胞培养液清洗1次，在2000r/min转速条件下离心5min后制成细胞悬液并在显微镜下计数，以5×104cells/mL接种细胞至60mm培养皿，置入温度为37℃、饱和湿度、体积比为5％的CO₂的培养箱中培养，每2天更换一次培养液，实现山羊前体脂肪细胞的体外培养。

本发明与现有技术相比，建立了山羊前体脂肪细胞体外培养的新模型，缩短细胞生长时间，获得的细胞形态好，细胞生长活力强，可完整的认识脂肪组织产生和增生的全过程，并可直接观察各种因素对过程的调控，是研究脂肪分化、脂肪生成、代谢以和肥胖等各种疾病发生机理的必备工具；其总体工艺简单，原理可靠，培养过程易控，培养效果好，环境友好。

附图说明：

图1为本发明培养的山羊前体脂肪细胞示意图，其中，图a为培养1天后的山羊前体脂肪细胞，图b为培养3天后的山羊前体脂肪细胞，图c为培养5天后的山羊前体脂肪细胞，从图中可明显看出所培养的山羊前体脂肪细胞贴壁数量大，增殖速度快。

图2为本发明培养的山羊前体脂肪细胞增殖活性曲线图。

图3为本发明培养的山羊前体脂肪细胞经红油O染色后的脂肪滴示意图片。

具体实施方式: