[发明专利]一种丝素软骨复合体义耳及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属组织工程和医用材料领域，具体涉及一种丝素软骨复合体义耳及其制备方法和在耳廓再造中应用。

背景技术

研究显示，先天性小耳畸形是较为常见的头面部畸形，据统计，其发病率为0.4～5.5/10000，其临床主要表现为外耳形态改变，外耳的基本结构消失或部分消失，仅有残余耳软骨及部分耳垂，甚至没有上述结构，而且常伴有外耳道闭锁、中耳畸形和颌面部畸形等症状。耳廓的畸形或缺少严重影响患者的容貌和心理健康。面对小耳畸形造成的压力，很多患者不能较好的适应社会，研究显示，小耳畸形患者的心理问题检出率明显高于健康正常人，因此，治疗小耳畸形的首选方案是进行早期治疗。目前，较好的治疗先天性小耳畸形的方法是耳再造术。耳郭具有复杂的三维解剖结构，理想的耳再造需再现出清晰的耳郭三维立体结构，因此耳再造术成为面部整形外科最困难和最富挑战性的手术之一。

耳支架的选取在耳廓再造术中起着至关重要的作用。自1920年Gilliesz开创全耳再造以来，先后有多种组织材料充当耳支架，如金属支架、硅橡胶支架、聚四氟乙烯支架、同种异体肋软骨、异种软骨、自体软骨、骨以及人造组织代用品等。就目前来看，硅橡胶支架、金属支架因为覆盖组织薄，易出现排斥反应等弊端，已经被淘汰；聚四氟乙烯支架较柔软，仅适合于部分耳缺损少的病例；同种异体肋软骨易吸收变形，致使手术成功率降低，异种肋软骨更易导致手术失败；自体肋软骨仍是目前应用最广泛、最为安全的支架材料，但存在取材痛苦，并发症多等弊端。因此选用更合适的耳廓支架进行耳廓再造是尤为需要的。

在众多的生物材料中，丝素有良好的生物相容性，无毒，无刺激性，在生物医用领域得到了日益广泛的应用，如医用丝素皮肤再生膜、隐形眼镜、细胞培养基及人工脑膜的实验研究等等。但迄今为止，国内外尚无丝素在耳廓再造方面应用的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种丝素软骨复合体及其在耳廓再造中的应用，尤其涉及提供一种丝素软骨复合体义耳及其制备方法；进一步的，提供丝素蛋白复合体义耳在临床耳廓再造中的应用。

本发明采用丝素软骨复合体作为支撑材料，以丝素蛋白为涂层，制成丝素软骨复合体义耳。本发明利用丝素的良好生物相容性和促进成细胞生长的作用，能避免自体取肋骨的伤害，减少并发症，又可以长期或永久有效存活。

本发明丝素软骨复合体可用作临床小耳畸形耳廓再造，能为探讨丝素软骨复合体在临床重建耳廓提供有意义的参考。

更具体的，本发明的一种丝素软骨复合体义耳，其特征在于，采用丝素复合物作支撑材料，以软骨细胞作为外层，制成丝素软骨复合体义耳，所述的丝素蛋白重量/体积浓度为6-20％；本发明的实施例中，优选所述的丝素蛋白重量/体积浓度为6-12％，更优选的丝素蛋白重量/体积浓度为10％。

本发明中，所述的丝素软骨复合体义耳制成正常耳廓结构。

本发明的丝素软骨复合体义耳通过下述方法制备，其包括步骤：

1)制备丝素蛋白

采用废桑蚕生丝在NaHCO3水溶液中脱胶，将脱胶丝溶于LiBr水溶液中，溶解，过滤，除去杂质，得丝素蛋白盐溶液，用去离子水透析除去溶液中的LiBr，得丝蛋白，再浓缩，PEG透析，丝素蛋白溶液离心去除杂质，留上清液，得重量/体积浓度为6-20％的丝素蛋白，本发明的实施例中优选所述的丝素蛋白重量/体积浓度为6-12％，更优选的丝素蛋白重量/体积浓度为10％；

2)制备丝素蛋白支架

用制得的丝素蛋白溶液与正丁醇混合，搅拌后，放入-20℃冰箱24小时，室温条件下，制得丝素蛋白多孔支架；去离子水清洗去除残存正丁醇，制得不同孔径尺寸的多孔丝素蛋白多孔支架；

3)软骨细胞分离和细胞培养

采用获得的无菌成年雄性SD大鼠关节软骨(由复旦大学动物实验中心提供)，先后采用胰蛋白酶EDTA消化(GIBCO，0.25％trypsin)，用II型胶原酶消化后，过滤，离心，重悬细胞，最后接种于悬浮瓶中培养(GIBCO，高糖DMEM+15％胎牛血清)，隔天换液；

4)软骨细胞增殖和转染

传代软骨细胞进行慢病毒转染(6enechem公司，效价：2E+8TU/ml，pGC-FU-GFP-3FLAG)；

5)丝素蛋白膜和软骨细胞体外培养

转染后，软骨细胞进行培养和传代，然后种植在多孔丝素蛋白上，将丝素蛋白膜与软骨细胞体外培养4周；制得丝素软骨复合体义耳材料。

经检测，结果显示：

1)软骨细胞形态学特点