[发明专利]高表达达托霉素的菌株及其筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及高表达达托霉素的菌株及其筛选方法，属于抗生素生产菌株及其筛选领域。

背景技术

达托霉素是A21978的N-癸酞基衍生物，由玫瑰孢链霉菌代谢产生。达托霉素分子由13个氨基酸组成的环脂肽与十碳的脂肪酸链所组成。当A-21978C发生脱酰作用脱去N末端连接基团时，可得到A-21978C核心，而A21978C核心的N末端再与癸酸发生酰化作用后即可得到达托霉素（结构式如下）。

达托霉素结构式

在过去四十多年中，在抗感染药物领域，代表全新结构类别进入临床应用的微生物药物，唯有以利萘唑胺为代表的唑脘酮类抗生素，和以达托霉素为代表的环脂肽类抗生素。但是，利萘唑胺上市不到一年就出现了交叉耐药菌的报道，达托霉素的上市，丰富了现有的抗生素结构类别。达托霉素结构新颖，作用机制特殊，它对多数革兰氏阳性菌都有快速杀灭活性，包括MRSA、VRSA、VISA和耐万古霉素肠球菌(VRE)等，它能在革兰氏阳性菌细胞膜上形成离子通道，破坏膜电位，扰乱细胞膜对氨基酸的转运、阻碍细菌细胞壁肽聚糖和胞壁酸酯的生物合成，从而杀死细菌。其独特的环脂肽结构及作用机制，使其将不会受到来自其它抗生素所致交叉耐药性的影响，具有广阔的市场前景。2003年9月，由于病人对新型抗生素的迫切需求，美国FDA经过快速审理程序批准注射用达托霉素（商品名Cubicin）用于治疗由一些革兰氏阳性敏感菌株引起的并发性皮肤及皮肤结构感染，如脓肿、手术切口感染和皮肤溃疡。之后又相继批准了达托霉素用于治疗金葡菌引起的菌血症和右侧心内膜炎。达托霉素的用药方式便捷，毒副作用小，临床上已经成为了“病原菌最后一道防线——万古霉素”的最佳替代品。

目前，达托霉素的制备方法主要有天然发酵法、前体诱导法、化学合成、酶法半合成等，由于达托霉素特有的环脂肽结构，并且含有特殊氨基酸成分，因而微生物发酵生产达托霉素还是目前较为常用的方法。玫瑰孢链霉菌（ATCC31568）作为生产达托霉素的原始菌株，其生产能力较低，无法满足市场需求，目前已有报道利用组合生物学的方法对达托霉素结构进行定向改造或者实现其整个合成基因簇的异源表达，虽然这些方法目标明确，但是操作复杂，目前仅停留在实验室水平，无法投入到工业生产，所以利用传统方法对达托霉素生产菌进行菌种选育，提升达托霉素生产水平，具有十分重要的现实意义。

在抗生素菌种选育过程中，抗生素抗性筛选是主要方法之一。由于抗生素生产基因和抗性基因成簇排列，并易发生共突变，这些突变可直接提高抗生素生产菌的生产能力。因此利用抗生素产生菌产抗能力与其抗性突变之间的相关性进行筛选，可以在很大程度上减少抗生素高产菌筛选的盲目性，提高对目的菌的筛选效率。

紫外诱变技术是微生物菌种选育过程中常用的方法之一，但是，使用紫外诱变结合利福平/庆大霉素的方法以提高达托霉素生产水平尚无报道。

发明内容

为了提高生产达托霉素的生产水平，本发明提供了三种高表达达托霉素的菌株，可获得产量最高达79.44mg/L的达托霉素。

一种高表达达托霉素的菌株Ge-27，用于生产达托霉素，该菌株Ge-27的分类命名为玫瑰孢链霉菌（Streptomyces roseosporus)，该菌株于2012年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.6899。该菌种可获得产量达79.44mg/L的达托霉素。

另一种高表达达托霉素的菌株RG-4，用于生产达托霉素，该菌株RG-4的分类命名为玫瑰孢链霉菌（Streptomyces roseosporus)，该菌株于2012年12月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.7014。该菌种可获得产量达77.87mg/L的达托霉素。

又一种高表达达托霉素的菌株Ri-5，用于生产达托霉素，该菌株Ri-5的分类命名为玫瑰孢链霉菌（Streptomyces roseosporus)，该菌株于2012年12月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.7015。该菌种可获得产量达75.07mg/L的达托霉素。