[发明专利]一种用磁性微球固定化米糠谷氨酸脱羧酶制备γ-氨基丁酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用磁性微球固定化米糠谷氨酸脱羧酶制备γ-氨基丁酸的方法，属于米糠深加工技术领域。。

背景技术

米糠作为稻谷的副产物，在中国来源十分丰富，可通过加工利用以实现其很高的附加值。米糠中的谷氨酸脱羧酶的酶活力很高，可以作为一种很好的催化剂，催化谷氨酸钠通过脱羧反应转化为GABA。GABA具有抗衰老、治疗癫痫、改善失眠等生理作用。目前世界上已经研究出GABA茶叶、高GABA粮食等，有良好的发展前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种用磁性微球固定化米糠谷氨酸脱羧酶制备γ-氨基丁酸的方法，用磁性壳聚糖微球固定从米糠中提取的谷氨酸脱羧酶，得到的GABA制备液中成分简单，且固定化酶易分离、可重复利用，从而实现GABA的制备与分离的同步进行，可扩大其应用范围。

本发明的技术方案：一种用磁性微球固定化米糠中谷氨酸脱羧酶制备γ-氨基丁酸的方法，先将米糠用酶提取液提取出谷氨酸脱羧酶，与制备好的磁性壳聚糖微球进行微粒反应，得到磁性固定化谷氨酸脱羧酶；将此固定化酶与反应液混合，加入0.01-0.05mol/L的谷氨酸钠作为底物，摇床反应得到GABA制备液；

(1)提取谷氨酸脱羧酶：将新鲜米糠加入酶提取液中，提取谷氨酸脱羧酶。其中酶提取液为pH5.6、0.05mol/LPBS缓冲液，2mmol/L2-巯基乙醇，2mmol/LEDTA-二钠，1mmol/LPLP，1mmol/L PMSF和10％甘油。

(2)磁性壳聚糖微球的制备：0.5g磁性纳米微粒与20mL2.5％的壳聚糖乙酸溶液混合，在搅拌下缓慢加入到80mL液体石蜡和4mL Span-80混合溶液中，常温搅拌30min，加入10mL8％的戊二醛，40℃搅拌1h，用1mol/L NaOH溶液调pH至9-10，70℃搅拌2h，用磁铁吸出微球，并先后用石油醚、丙酮、蒸馏水反复洗涤，于60℃下真空干燥。磁性纳米微粒应粒径分布均匀，以保证固定后的磁性壳聚糖微球粒径分布均匀。

(3)固定谷氨酸脱羧酶：将制备好的磁性壳聚糖微球在pH4.8-6.4、0.05mol/L PBS缓冲液中浸泡12h，加入1％-3％戊二醛交联2-6h，用PBS缓冲液反复洗涤磁性微球，再加入一定浓度的谷氨酸脱羧酶酶液固定1-5h，用PBS缓冲液反复洗涤磁性微球。

(4)制备GABA：将固定化酶与pH5.6、0.01-0.05mol/L HAc-NaAc缓冲液混合，加入0.01-0.05mol/L的谷氨酸钠作为底物，在45℃下摇床反应6-14h得到GABA制备液。

本发明的有益效果：采用本发明方法制备的固定化谷氨酸脱羧酶，与游离酶相比，由于其具有磁性，可以利用磁铁直接从反应体系中完全分离，操作方便简单。本发明方法制备的GABA，与传统的直接富集法相比，成分相对简单，蛋白含量和糖含量基本为零。并且在过程中实现了GABA的制备与分离同步进行，简化了操作，扩大了其应用范围。

附图说明

图1为一种用磁性微球固定化米糠谷氨酸脱羧酶制备γ-氨基丁酸的方法的工艺流程图。

具体实施方式

实施例1

称取10g磁性壳聚糖微球，在pH5.6、0.05mol/LPBS缓冲液中浸泡12h，使其充分溶胀。加入浓度为1.5％的戊二醛溶液，常温下避光交联4h。用磁铁吸出磁性微球，并用PBS缓冲液充分洗涤至检测不到戊二醛。称取冷冻干燥的谷氨酸脱羧酶，配制成蛋白质含量为1mg/mL的溶液进行复溶，离心取上清液100mL，加入上述磁性微球，4℃下固定3h。用磁铁吸出磁性微球，并用PBS缓冲液充分洗涤至无游离酶存在。将该磁性微球加入100mL pH5.6、0.05mol/LHAc-NaAc缓冲液中，再加入0.04mol/L谷氨酸钠底物，在45℃水浴摇床上反应8h，用磁铁吸出磁性微球，溶液即为GABA制备液。

实施例2

称取10g磁性壳聚糖微球，在pH5.2、0.05mol/LPBS缓冲液中浸泡12h，使其充分溶胀。加入浓度为2％的戊二醛溶液，常温下避光交联5h。用磁铁吸出磁性微球，并用PBS缓冲液充分洗涤至检测不到戊二醛。称取冷冻干燥的谷氨酸脱羧酶，配制成蛋白质含量为1mg/mL的溶液进行复溶，离心取上清液100mL，加入上述磁性微球，4℃下固定2h。用磁铁吸出磁性微球，并用PBS缓冲液充分洗涤至无游离酶存在。将该磁性微球加入100mL pH5.6、0.05mol/L HAc-NaAc缓冲液中，再加入0.03mol/L谷氨酸钠底物，在45℃水浴摇床上反应10h，用磁铁吸出磁性微球，溶液即为GABA制备液。