[发明专利]一种应用于第二代测序的简捷廉价的基因组样品破碎方法

说明书

技术领域

本发明涉及高通量测序建库领域，尤其基因组DNA样品破碎的方法及其运用。

背景技术

高通量测序技术中的数据质量控制是测序过程中的重要环节，样本文库的质量则是获取高质量的测序数据的前提和基础。获得适当大小的DNA片段是测序前样本文库制备的必要步骤。如果片段太长，会导致数据整理分析时拼接的困难；如果片段太短，会导致数据量的降低、浪费以及增加测序成本。核酸片段化的技术主要分为3大类：一类是化学法，主要应用于mRNA的样本制备过程；一类是酶切法，主要应用于数字基因表达谱的样本制备过程；一类是物理法，主要应用于DNA的样本制备过程，物理法中应用最多是使用超声波破碎仪破碎样本。

超声波破碎仪的种类和型号都很多，为满足高通量测序样本文库构建的基本要求，选择仪器时要关注：(1)样本之间不能有任何交叉污染的可能，高通测序是灵敏的测试，只要有任何其他DNA在其中都会被当作测序对象进行测序，会造成测序数据的污染和不可信；(2)需要的样本量较少，一些临床样本，稀有动植物的样本，或残存物质中不可再获得的样本都是十分珍贵的，基因组DNA的提取量都不是很高，基本是微克级别，所以有些需要大量样本才能操作的仪器，在高通量测序文库构建中是不建议使用的；(3)可重复性要高，高通量测序的一个特点就是平行处理多个样本，如果破碎条件不稳定，那么意味着各个样本的可比性、重复性和稳定性很差，会造成实验不可重复。基于以上3条基本原则，目前用于高通量测序样本破碎的超声波破碎仪主要有：非接触式全自动超声破碎仪Bioruptor和和自动聚焦声波样本处理仪CovarisS220。CovarisS220可以在较短的时间里获得比较理想的片段，重复性很好，操作简单，就高通量测序方向上的应用来说，CovarisS220有很大优势。但是仪器和耗材比较昂贵，而且这台仪器占实验台的面积比较大，还需另配电脑配合操作；Bioruptor仪器价格相对低廉，没有特殊耗材，所占面积有限，不需电脑操作，在摸索好仪器的使用规律的前提下，可以得到理想片段，但是操作相对繁琐。

因此，本发明将提供应用另外一种超声破碎仪对基因组DNA样品进行破碎的方法，即满足廉价要求，又可以操作简捷。大大节省样品破碎的时间和操作复杂度，还可以满足不同长度插入片段大小的文库样本需求。

发明内容

为了实现上述技术目的，本发明提供了一种简捷廉价的可以应用于第二代测序建库的样品破碎方法及其运用流程。

本发明一个目的是提供一种简捷廉价的可以用于第二代测序样品破碎的方法。

本发明提供的可以用于基因组DNA样品破碎的超声设备为普通超声波清洗器，型号为KQ-50E，制造商为江苏昆山舒美，价格为800元人民币。使用该设备可以实现快速简捷的进行DNA样品破碎，不需要其他任何昂贵的仪器和耗材。

本发明提供的可以用于第二代测序样品破碎的方法为利用所述的超声波清洗器进行DNA样品破碎。

所述的DNA样品可以是来自于动物的DNA、或是植物的、或是其他任何微生物或非生物来源的DNA样品。

所述的样品包括DNA样品，但是不仅限于DNA样品，也可以使RNA样品或其他任何核酸样品。

所述的快速简捷的进行DNA样品破碎的方法主要包括以下步骤：

1)打开该超声破碎仪的盖子；

2)添加冰水混合物至水深为4.5cm；

3)在1.5ml离心管中加入需要破碎的样品；

4)加入的样品的体积范围为20～200ul；

5)加入的样品的质量范围为10～10000ng；

6)将含有待破碎样本的离心管使用一个浮漂将其置于超声波清洗器的中央位置；

7)打开仪器开关，根据所需要样品破碎的大小，将时间设定为90s(500bp的插入片段)，或120s(300bp的插入片段)或360s(180bp的插入片段)；

8)将温度设定调至0；

9)盖上盖子运行超声清洗仪器；

10)运行结束，取出离心管，直接进行下一步建库的操作，不需要进行样品的纯化。

本发明的第二个目的是提供一种运用上述破碎方法对DNA样品进行建库并进行高通量测序流程，包括如下步骤：

1)将所待测样品基因组DNA用如前所述的超声波清洗器进行破碎；

2)对步骤1)得到的破碎产物进行末端补平，加dATP，并进行接头的连接；

3)对步骤2)得到的连接产物进行纯化并定量后进行PCR扩增，并将扩增产物纯化后，在Illumina公司的Hiseq2000测序平台进行测序；