[发明专利]基于新型质量差异标签的生物体系中羧酸类信号分子的相对定量方法

说明书

技术领域

本发明提供一种基于新型质量差异标签分子对定量生物样品体系中羧酸类信号分子的相对含量的方法，所述方法是一种高灵敏度、高通量的相对定量方法。本发明还提供一种由轻/重同位素对标记的质量差异标签分子对及其合成方法。

背景技术

羧酸类信号分子是生物内天然存在的某些含羧基的化学分子，其作用是在细胞间和细胞内传递信息，参与调控生物生长发育的很多过程，其研究成果具有重大的应用价值。为了深入研究羧酸类信号分子的作用机理，有必要对它们的含量变化展开研究。但是，羧酸类信号分子的定量分析主要面临以下挑战：含量较低；生物体中存在其它高含量次生代谢产物的干扰；为了研究信号分子的时间-空间分布和/或互作网络，要求对多种信号分子及前体或代谢物同时进行含量分析；一些生物材料，如突变体，非常稀少珍贵；样品通量大，样品处理过程步骤多，耗时长。因此，羧酸类信号分子的检测难度很大，要求十分灵敏的、准确的、多种信号分子同时测定的高通量分析方法。

目前应用较多的定量方法是基于质谱仪的稳定同位素稀释法，在负离子模式下直接对羧酸类信号分子进行绝对定量分析。但该方法主要有以下两个缺陷：对一些信号分子无法检测或灵敏度差；需使用稳定同位素标记的信号分子标准品作为内标，有的难以获得，仅有的标准品种类稀少、价格昂贵。以上缺陷都限制了羧酸类信号分子的定量分析。

很多情况下，生物和植物学家更关注羧酸类信号分子在对比的一组样品中的含量差异，因而可以将蛋白质组学中的相对定量思路应用到此类信号分子的相对定量分析中。目前有报道的唯一相关的技术是利用3-溴-2-氧代丙基吡啶及其氘标试剂为质量差异标签研究了7个茉莉酸类信号分子的相对含量。但该方法的目标仅是一类信号分子，无法满足对多种类信号分子的同时相对定量分析及互作网络研究；此外，该体外标记方式的误差较大，因为对比样品在合并分析之前经过了单独的提取、衍生化标记和固相萃取处理，这些过程的误差无法补偿，且单独过固相萃取柱增加了分析的成本、时间和精力，样品通量较低[Huang YQ，etal.(2011)Use ofisotopemass probes for metabolic analysis of the j asmonate biosynthetic pathway.Analyst136：1515-1522]。

为弥补上述方法的不足，我们开发了基于新型质量差异标签的色谱-串联质谱法(Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry，LC-MS/MS)对羧酸类信号分子进行相对定量分析。通过化学衍生化方法，使对比的两种样品(如对照组和处理组)在一步溶剂提取之后即分别与一对结构相同、但元素组成不同的质量差异标签，(2-溴乙基)三甲基溴化铵[Bromocholine Bromide(BETA)，分子式C₅H₁₃NBr₂，轻同位素标签分子]和其9氘代同位素标记的标签分子D₉-BETA[分子式C₅H₄D₉NBr₂，重同位素标签分子]反应，反应后，将对比的两种样品的反应产物合并进行后续的样品预处理及LC-MS/MS分析。得到的峰面积比即该羧酸类信号分子在一组对比样品中的相对含量。本方法首次实现了多种类羧酸类信号分子的同时、高灵敏、高通量、准确的相对定量分析，有助于推动羧酸类信号分子时间-空间分布及互作网络、代谢组学等相关研究的发展。

发明内容

在第一方面中，本发明提供一种由轻/重同位素对标记的质量差异标签分子对，所述质量差异标签分子对包含结构相同、但元素组成不同的两种标签分子，即轻同位素标签分子和重同位素标签分子，这两种标签分子为式(I)所示：

其中：

结构部分A中，R₁是H或者含有1-3个碳原子的低级烷基，

R₂是H或者含有1-3个碳原子的低级烷基，

R₃是H或者含有1-3个碳原子的低级烷基，

其中R₁、R₂和R₃可以是相同的或不同的；

结构部分B中，Y是H或O，

[C]_n是含有1-8个碳原子的直链、支链脂肪烷基，或

是含有5-7个碳原子的环烷基；

结构部分C中，X是I，Br，Cl或F；