[发明专利]老年大鼠脑血管内皮细胞原代培养方法

权利要求书

1.一种老年大鼠脑血管内皮细胞原代培养方法，其特征在于，步骤如下：

（1）将20～22月龄的老年大鼠断头后，剥去大鼠头部皮肤，然后把大鼠头浸泡在0℃的含2%（体积百分数）胎牛血清的分离液中5～10分钟，取出，取出脑组织，取灰质部分，制得样品组织；

（2）把样品组织置于5ml冰冷的含8%（体积百分数）胎牛血清的分离液的培养皿中剪成样品组织小块，补加8%（体积百分数）胎牛血清的分离液至25ml，经吹打分散和生物酶消化后，制得分散细胞；

（3）向步骤（2）制得的分散细胞补加10ml8%（体积百分数）胎牛血清的分离液，混匀后第一次离心；移去上清，加20ml含20%（体积百分数）牛血清白蛋白的DMEM培养基，吹打混匀后，第二次离心，取最下层的沉淀，制得毛细血管；

（4）将步骤（3）制得的毛细血管重悬于1ml的分离液中，再加入7.9ml的分离液，经生物酶消化后，制得毛细血管悬液；

（5）将步骤（4）制得的毛细血管悬液，经第三次离心后，移去上清，沉淀重悬于2ml的分离液中，然后轻轻地把悬液置于Percoll浓度梯度离心液的顶部；在4℃，1000g离心10分钟，分为六层，取第三层悬浊液即为脑血管内皮细胞；

（6）将步骤（5）制得的脑血管内皮细胞溶于1ml的内皮细胞培养液中，于在10cm的培养板或6孔板中培养，正常条件下培养1天，然后用1×PBS缓冲液洗除去死亡的细胞，用含3～4μM/ml嘌呤霉素的内皮细胞培养液纯化2～3天后，更换为正常的脑血管内皮细胞培养液培养7～10天，用0.01%（重量百分数）胰酶或含1mM EDTA的PBS消化传代或冻存即可。

所述培养板或6孔板制备方法如下：先用1×Collagen IV铺板30分钟，然后再用1×Fibronectin铺板30分钟。

2.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（1）中分离液为在DMEM培养基的基础上，每百毫升加入如下组分：

1ml青霉素-链霉素溶液；100μl硫骏庆大霉素。

3.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（1）中取出脑组织，取灰质部分按如下步骤操作：切开两个大脑半球，分别把两个脑半球在消毒的普通滤纸上滚动一周，然后去除脑干和白质部分，保留灰质部分。

4.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（2）中生物酶消化按如下步骤操作：

将吹打分散的样品组织小块加入2.5ml的胶原酶和250μl的DNA酶溶液，在36℃的水浴摇床中100rpm/min消化90分钟；然后吹打分散后，继续消化30分钟。

5.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（3）中的第一次离心为在4℃，600g离心8分钟；第二次离心为在4℃，1000g离心20分钟。

6.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（4）中的经生物酶消化按如下步骤操作：

1ml的胶原酶和100μl的DNA酶溶液，混匀后在37℃、100rpm/min的条件下水浴摇床中消化90分钟。

7.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（5）中离心液组分如下：

Percoll8ml+1×PBS 15.2ml+10×PBS(不含钙镁)0.8ml+FBS 0.8ml。

8.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（5）中的第三次离心为在4℃，600g离心5分钟。

9.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（6）中的内皮细胞培养液为在每百毫升DMEM培养基的基础上加入如下组分：

20ml血浆来源的血清，100μl青霉素-链霉素溶液，1.0ml L-谷氨酰胺，100μl硫骏庆大霉素，1.0ml肝素，150μl碱性纤维生子因子，1.0ml内皮细胞生长补充因子，300μl维生素C，100-150μl血管内皮生长因子，100-150μl胰岛素样生长因子-1，100-150μl内皮生子因子。