[发明专利]老年大鼠脑血管内皮细胞原代培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及老年大鼠脑血管内皮细胞原代培养方法，属于生物技术技术领域。

背景技术

现有的大鼠脑血管内皮细胞原代培养，取材来源均为新生鼠（<10天，35～50g），幼年鼠（<3weeks，80～100g）或2-3月年轻成年鼠（200g～300g），而且培养的脑血管内皮细胞只能传代一次，不能冻存，利用大鼠脑血管内皮原代培养细胞作为实验材料导致消耗时间长和成本高的缺点，如：Bowman PD,Betz AL,Ar D,Wolinsky JS,Penney JB,Shivers RR,Goldstein GW.1981.Primary Culture of Capillary Endothelium From Rat Brain.IN VITRO.17(4),353-362。

老年大鼠（19～22月，900g～1200g）脑血管内皮细胞培养成功的先例至今未见报道；现有的取材对象和培养技术不能满足体外建立老年血脑屏障模型，研究老年血脑屏障的生理特性，以及老年神经系统疾病与血脑屏障相关的退行性病变的要求。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种老年大鼠脑血管内皮细胞原代培养方法。

本发明技术方案如下：

一种老年大鼠脑血管内皮细胞原代培养方法，步骤如下：

（1）将20～22月龄的老年大鼠断头后，剥去大鼠头部皮肤，然后把大鼠头浸泡在0℃的含2%（体积百分数）胎牛血清（FBS）的分离液中5～10分钟，取出，取出脑组织，取灰质部分，制得样品组织；

（2）把样品组织置于5ml冰冷的含8%（体积百分数）FBS的分离液的培养皿中剪成样品组织小块，补加8%（体积百分数）FBS的分离液至25ml，经吹打分散和生物酶消化后，制得分散细胞；

（3）向步骤（2）制得的分散细胞补加10ml8%（体积百分数）FBS的分离液，混匀后第一次离心；移去上清，加20ml含20%（体积百分数）BSA（牛血清白蛋白，购自Sigma公司，商品号a3059）的DMEM培养基，吹打混匀后，第二次离心，取最下层的沉淀，制得毛细血管；

（4）将步骤（3）制得的毛细血管重悬于1ml的分离液中，再加入7.9ml的分离液，经生物酶消化后，制得毛细血管悬液；

（5）将步骤（4）制得的毛细血管悬液，经第三次离心后，移去上清，沉淀重悬于2ml的分离液中，然后轻轻地把悬液置于Percoll浓度梯度离心液的顶部；在4℃，1000g离心10分钟，分为六层，取第三层悬浊液即为脑血管内皮细胞；

（6）将步骤（5）制得的脑血管内皮细胞溶于1ml的内皮细胞培养液中，于在10cm的培养板或6孔板中培养，正常条件下培养1天，然后用1×PBS缓冲液洗除去死亡的细胞，用含3～4μM/ml嘌呤霉素的内皮细胞培养液纯化2～3天后，更换为正常的脑血管内皮细胞培养液培养7～10天，用0.01%（重量百分数）胰酶(Typsin)或含1mM EDTA的PBS消化传代或冻存即可。

所述培养板或6孔板制备方法如下：先用1×Collagen IV铺板30分钟，然后再用1×Fibronectin铺板30分钟。

根据本发明优选的，所述步骤（1）中分离液为在DMEM培养基的基础上，每百毫升加入如下组分：

1ml青霉素-链霉素溶液；100μl硫骏庆大霉素。

根据本发明优选的，所述步骤（1）中取出脑组织，取灰质部分按如下步骤操作：切开两个大脑半球，分别把两个脑半球在消毒的普通滤纸上滚动一周，然后去除脑干和白质部分，保留灰质部分。

根据本发明优选的，所述步骤（2）中的样品组织小块体积为1-2mm³。

根据本发明优选的，所述步骤（2）中生物酶消化按如下步骤操作：

将吹打分散的样品组织小块加入2.5ml的胶原酶和250μl的DNA酶溶液，在36℃的水浴摇床中100rpm/min消化90分钟；然后吹打分散后，继续消化30分钟。

根据本发明优选的，所述步骤（3）中的第一次离心为在4℃，600g离心8分钟；第二次离心为在4℃，1000g离心20分钟。

根据本发明优选的，所述步骤（4）中的经生物酶消化按如下步骤操作：

1ml的胶原酶和100μl的DNA酶溶液，混匀后在37℃、100rpm/min的条件下水浴摇床中消化90分钟。

根据本发明优选的，所述步骤（5）中用长的腰椎穿刺针取第三层液体。

根据本发明优选的，所述步骤（5）中离心液组分如下：