[发明专利]一种牛滋养层干细胞建系方法

权利要求书

1.一种牛滋养层干细胞建系方法，其特征在于，在体外条件下，将经过链霉蛋白酶处理去透明带后的牛囊胚接种于经丝裂霉素处理后的小鼠胎儿成纤维细胞和Wnt-3A小鼠皮下结缔组织细胞的饲养层中，加入2i小分子抑制剂培养液进行细胞的传代培养，从而构建牛滋养层干细胞系。

2.根据权利要求1所述的建系方法，其特征在于，所述2i小分子抑制剂培养液配方以1L计为：

其中，PD0325901为非ATP竞争性的MAPK激酶MEK抑制剂，分子式C₁₆H₁₄F₃IN₂O，分子结构如式（I）所示：

CHIR99021为GSK3β选择性抑制剂，分子式C₂₂H₁₈Cl₂N₈，分子结构如式（II）所示：

3.根据权利要求1所述的建系方法，其特征在于，所述囊胚为发育到第7天的牛囊胚。

4.根据权利要求1所述的建系方法，其特征在于，小鼠胎儿成纤维细胞和L细胞按1:1比例混合。

5.根据权利要求4所述的建系方法，其特征在于，待小鼠胎儿成纤维细胞和L细胞汇合度达60%-80%时，用丝裂霉素处理，即得饲养层。

6.根据权利要求5所述的建系方法，其特征在于，丝裂霉素的使用浓度为16-18μg/ml，处理时间为2-3h。

7.根据权利要求6所述的建系方法，其特征在于，丝裂霉素的使用浓度为17μg/ml，处理时间为3h。

8.根据权利要求1-7任一项所述的建系方法，其特征在于，细胞的培养条件为：38.5℃，5%CO₂。

9.根据权利要求8所述的建系方法，其特征在于，细胞传代包括以下步骤：

1）在显微镜下，用注射器的针头将4孔板内贴壁生长的牛滋胚层干细胞剥离，并用移液枪将滋胚层干细胞转移到60mm细胞培养皿中；

2）用注射器针头的斜面将大片的滋胚层干细胞切成2-3个小片。同时将泡状的滋胚层干细胞切成小片，将切好的小片滋胚层干细胞接种于4孔板内新鲜的饲养层中，进行细胞的传代培养，传代后第3d按300μl/孔更换新鲜的2i小分子抑制剂培养液。

10.一种用于牛滋养层干细胞体外建系的培养液，其配方以1L计为：

其中，PD0325901为非ATP竞争性的MAPK激酶MEK抑制剂，分子式C₁₆H₁₄F₃IN₂O，分子结构如式（I）所示：

CHIR99021为GSK3β选择性抑制剂，分子式C₂₂H₁₈Cl₂N₈，分子结构如式（II）所示：