[发明专利]一种牛滋养层干细胞建系方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞生物学和分子生物学领域，具体地说，涉及一种牛滋养层干细胞建系方法。

背景技术

滋养层干细胞（Trophoblast stem cells，TSC）是胚胎发育过程中分化为胎盘部分的前体细胞。在小鼠中，TSC可经囊胚一端的滋养外胚层（Trophectoderm，TE）贴壁后获得。与来自于囊胚的内细胞团（Inner cell mass，ICM）的胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ESC）的多能性相比，TSC的分化发育能力是有限的。目前在一些物种中获得的TSC已经用于研究细胞的分化现象（Flechon.J.E.1995;Talbot,2000;Miyazaki,2002;Hashizume K,2006）。

2i体系主要包含了CHIR99021和PD0325901。CHIR99021是一种针对于GSK3(glycogen synthase kinase3)且特性明确的、高效选择性的小分子抑制剂(Murray等，2004)。PD0325901是一种MEK（mitogen-activated protein kinase kinase）的小分子抑制剂。已有研究显示在MEF细胞和3i（CHIR99021,PD184352,SU5402）的培养条件下，可从Rat囊胚获得有生殖嵌合能力的大鼠ES细胞（Ping Li,2008）。同时该研究显示以L细胞和2i（CHIR99021，PD0325901）的培养条件下获得的Rat ES贴壁生长更稳定且该ES细胞可用于遗传操作。

目前，在家畜TSC研究方面，国外有相关培养体系的研究报道并获得了一些TSC细胞，但未见关于牛TSC体外长期传代并建系的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种牛滋养层干细胞建系方法，为转基因克隆牛的研究与生产提供可用于基因转染和体外长期筛选的干细胞，获得的细胞可用于进一步牛胚胎着床和胎盘分化的研究。

为了实现本发明目的，本发明的一种牛滋养层干细胞建系方法，其是在体外条件下，将经过链霉蛋白酶处理去透明带后的牛囊胚接种于经丝裂霉素处理后的小鼠胎儿成纤维细胞和Wnt-3A小鼠皮下结缔组织细胞的饲养层中，加入2i小分子抑制剂培养液进行细胞的传代培养，从而构建牛滋养层干细胞系。

所述2i小分子抑制剂培养液配方以1L计为：

其中，PD0325901为非ATP竞争性的MAPK激酶MEK抑制剂，分子式C₁₆H₁₄F₃IN₂O，分子结构如式（I）所示：

CHIR99021为GSK3β选择性抑制剂，分子式C₂₂H₁₈Cl₂N₈，分子结构如式（II）所示：

前述的牛滋养层干细胞建系方法中，所述囊胚优选为发育到第7天的牛囊胚。

前述的牛滋养层干细胞建系方法中，小鼠胎儿成纤维细胞和L细胞按1:1比例混合。

前述的牛滋养层干细胞建系方法中，待小鼠胎儿成纤维细胞和L细胞汇合度达60%-80%时，用丝裂霉素处理，即得饲养层。

前述的牛滋养层干细胞建系方法中，丝裂霉素的使用浓度为16-18μg/ml，处理时间为2-3h。优选丝裂霉素的使用浓度为17μg/ml，处理时间为3h。

前述的牛滋养层干细胞建系方法中，细胞的培养条件为：38.5℃，5%CO₂。

前述的牛滋养层干细胞建系方法中，细胞传代包括以下步骤：

1）在显微镜下，用注射器的针头将4孔板内贴壁生长的牛滋胚层干细胞剥离，并用移液枪将滋胚层干细胞转移到60mm细胞培养皿中；

2）用注射器针头的斜面将大片的滋胚层干细胞切成2-3个小片。同时将泡状的滋胚层干细胞切成小片，将切好的小片滋胚层干细胞接种于4孔板内新鲜的饲养层中，进行细胞的传代培养，传代后第3d按300μl/孔更换新鲜的2i小分子抑制剂培养液。

本发明进一步提供一种用于牛滋养层干细胞体外建系的培养液，其配方以1L计为：