[发明专利]一种重组人粒细胞集落刺激生长因子用微生物筛选而制备的方法，其药物组合物及制剂

权利要求书

1.一种重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法，其特征在于，所述的制备方法的步骤为：

（1）选用重组人粒细胞集落刺激因子的工程菌进行发酵培养；

（2）对发酵培养基所得菌体进行超声破碎，收集包涵体，用包涵体洗涤液进行洗涤后低温离心；

（3）包涵体中加入包涵体溶解液，4℃条件下8～12小时后，离心得到包涵体提取液；

（4）在2～8℃条件下，采用SephacrylS-200凝胶柱对提取液进行分离，收集复性的重组人粒细胞集落刺激因子馏分；

（5）再采用SephadexG25柱进行分离，得到人重组人细胞集落刺激因子。

2.根据权利要求1所述的重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法，其特征在于，在步骤（2）中，将收集的菌体用TE缓冲液洗涤1～3次，然后采用超声破碎0.5～1小时，低温离心，收集包涵体；再加入包涵体洗涤液，0～4℃条件下混合20～60分钟，低温离心。

3.根据权利要求2所述的重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述的TE缓冲液为：20mmol/L Tris-HCl+1mmol/L EDTA，pH8.0；包涵体洗涤液为：20mmol/LTris-HCl+1mmol/L EDTA+2mmol/L脲+0.5%Tritonx-100，pH8.0；包涵体重量与包涵体洗涤液的体积比为1：10～20，优选1：10。

4.根据权利要求1所述的重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法，其特征在于，在步骤（3）中，所述的包涵体溶解液为：20mmol/L Tris-HCl+1mmol/L EDTA+7mmol/L盐酸胍+20mmol/L DTT，pH8.0；包涵体质量与包涵体溶解液的体积之比为：1：5～10，优选1：10。

5.根据权利要求1所述的重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法，其特征在于，在步骤（4）中，所述的色谱条件为：

流动相为：0.15mol/L NaCl+0.05mol/L Tris-HCl+1mmol/L EDTA+2mmol/L脲+0.8mmol/LGSH+0.2mmol/L GSSG，pH7.8；

流速为2mL/min；

检验波长为280nm。

6.根据权利要求5所述的重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法，其特征在于，在步骤（4）中，所述的SephacrylS-200凝胶柱先用流动相平衡，然后进样对包涵体提取液进行分离。

7.根据权利要求1所述的重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法，其特征在于，在步骤（5）中，将收集的复性的人重组粒细胞集落刺激因子馏分用10%的冰醋酸调节至pH为4.0～4.5，优选pH为4.2；低温离心20～40分钟得上清液，上清液上SephadexG25柱，用洗脱液洗脱，收集主峰进行分离，得到人重组人细胞集落刺激因子。

8.根据权利要求7所述的重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法，其特征在于，在步骤（5）中，所述的SephadexG25柱先采用pH为4.0～4.5的20mmol/L的醋酸钠平衡，优选为pH为4.2；所述的洗脱液为：10mmol/L的氯化钠+15mmol/L的醋酸钠，pH为4.4。

9.一种由权利要求1所述的制备方法制备得到的重组人粒细胞集落刺激因子的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物的组成为：重组人粒细胞集落刺激因子100重量份，甘露醇5～100重量份。

10.根据权利要求9所述的重组人粒细胞集落刺激因子的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物的剂型为冻干粉针或水针；其中，当所述的剂型为水针时，药物组合物的组成为重组人粒细胞集落刺激因子100重量份，甘露醇5～10重量份；当所述的剂型为冻干粉针时，药物组合物的组成为重组人粒细胞集落刺激因子100重量份，甘露醇50～100重量份。