[发明专利]一种重组人粒细胞集落刺激生长因子用微生物筛选而制备的方法，其药物组合物及制剂

说明书

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体讲，涉及一种重组人粒细胞集落刺激生长因子用微生物筛选而制备的方法，其药物组合物及制剂。

背景技术

粒细胞集落刺激因子（G-CSF）是一种糖蛋白，含有174个氨基酸，分子量约为20000。主要由内毒素、TNF-α和IFN-γ可活化单核细胞和巨噬细胞产生。G-CSF基因全长2.5kb，包括5个外显子和4个内含子，G-CSF有5个半胱氨酸，Cys36与Cys42，Cys74与Cys64之间形成两对二硫键，Cys17为不配对半胱氨酸，二硫键对于维持G-CSF生物学功能是必须的因素。人和小鼠G-CSF在氨基酸水平上有73%同源性，并具有相互交叉的生物学活性。G-CSF主要作用于中性粒细胞系(lineage)造血细胞的增殖、分化和活化。

重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）作用于造血祖细胞，促进其增殖和分化，其重要作用是刺激粒、单核巨噬细胞成熟，促进成熟细胞向外周血释放，并能促进巨噬细胞及噬酸性细胞的多种功能。临床主要用于预防和治疗肿瘤放疗或化疗后引起的白细胞减少症、治疗骨髓造血机能障碍及骨髓增生异常综合征、预防白细胞减少可能潜在的感染并发症、以及使感染引起的中性粒细胞减少的恢复加快。

人粒细胞集落刺激生长因子是一种造血生长因子,它在刺激增殖、分化和活化血细胞的功能等方面具有重要的作用；其分子在17位包含一个自由半胱氨酸，并含有两对二硫键，即Cys36-Cys42和Cys64-Cys74，这两对二硫键对于其活性是必须的；然而，hG-CSF的来源是非常有限的，因此在工业中，必须用基因工程的方法来生产它。通常在E.coli中表达重组hG-CSF（rhG-CSF），它以不溶于水的包涵体的形式存在，因此必须用高浓度的变性剂溶解，这样溶解得到的蛋白是以去折叠状态存在的，必须对其进行复性，然后采用多步色谱步骤对其进行纯化，但其质量回收率不到20%。

为此，本发明提出了一种回收率高、生物活性高的重组人粒细胞集落刺激生长因子的制备方法。

发明内容

本发明的发明目的在于提出了一种重组人粒细胞集落刺激生长因子用微生物筛选而制备的方法。

为了实现本发明的目的，采用的技术方案为：

一种重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法，其特征在于，所述的制备方法的步骤为：

（1）将重组人粒细胞集落刺激因子的工程菌进行发酵培养；

（2）对发酵培养基所得菌体进行超声破碎，收集包涵体，用包涵体洗涤液进行洗涤后低温离心；

（3）包涵体中加入包涵体溶解液，4℃条件下8～12小时后，离心得到包涵体提取液；

（4）在2～8℃条件下，采用SephacrylS-200凝胶柱对提取液进行分离，收集复性的重组人粒细胞集落刺激因子馏分；

（5）再采用SephadexG25柱进行分离，得到人重组人细胞集落刺激因子。

本发明的第一优选技术方案为：在步骤（2）中，将收集的菌体用TE缓冲液洗涤1～3次，然后采用超声破碎0.5～1小时，低温离心，收集包涵体；再加入包涵体洗涤液，0～4℃条件下混合20～60分钟，低温离心。

本发明的第二优选技术方案为：在步骤（2）中，所述的TE缓冲液为：20mmol/LTris-HCl+1mmol/L EDTA，pH8.0；包涵体洗涤液为：20mmol/L Tris-HCl+1mmol/L EDTA+2mmol/L脲+0.5%Tritonx-100，pH8.0；包涵体重量与包涵体洗涤液的体积比为1：10～20，优选1：10。

本发明的第三优选技术方案为：在步骤（3）中，所述的包涵体溶解液为：20mmol/LTris-HCl+1mmol/L EDTA+7mmol/L盐酸胍+20mmol/L DTT，pH8.0；包涵体质量与包涵体溶解液的体积之比为：1：5～10，优选1：10。

本发明的第四优选技术方案为：在步骤（4）中，所述的色谱条件为：

流动相为：0.15mol/L NaCl+0.05mol/L Tris-HCl+1mmol/L EDTA+2mmol/L脲+0.8mmol/LGSH+0.2mmol/L GSSG，pH7.8；

流速为2mL/min；

检验波长为280nm。

本发明的第五优选技术方案为：在步骤（4）中，所述的Superdex75凝胶柱先用流动相平衡，然后进样对包涵体提取液进行分离。