[发明专利]一种筛选酸性浸矿体系中新基因的宏基因组芯片及其筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及从酸性浸矿微生物群落中快速筛选新颖基因的宏基因组芯片及筛选方法。

背景技术

酸性浸矿体系中，浸矿微生物群落通过氧化分解矿物使金属离子进入溶液。了解浸矿微生物群落的代谢调控与浸出过程的关系，发掘关键代谢途径相关的新颖基因有助于提高微生物冶金的效率。

利用传统方法研究微生物的代谢调控或者功能基因，必须先分离纯化微生物，然后通过形态观察或生理生化检测分析其代谢调控方式。新基因的研究，则要通过体外表达和酶学测定确定其功能特性。然而，极端酸性浸矿体系中的大部分微生物难以分离纯化培养，利用传统的方法难以开展代谢调控和基因功能的研究。

发明内容

本发明的目的在于通过构建酸性浸矿微生物群落宏基因组大片段文库，提供一种宏基因组基因芯片，以及利用该芯片快速筛选宏基因组文库中的新颖目标基因的方法，从而获得不能分离纯化培养的微生物的遗传基因信息，解决传统方法无法分析未分离纯化培养微生物遗传和代谢调控特性的难题。

一种筛选酸性浸矿体系中新基因的宏基因组芯片，是由以下方式构建的：

利用德兴酸性矿坑废水中微生物群落的总DNA构建大片段的宏基因组文库，以宏基因组文库中提取的7776个fosmid质粒为探针，将探针通过基因芯片点样仪打印在玻片表面，打印后的宏基因组芯片在室温下干燥过夜，最后使用紫外交联仪照射下进行交联即可。

具体包括以下步骤：

采用0.2μm的尼龙膜过滤酸性浸矿体系中的酸性浸出液，得到生物质富集物，液氮研磨法提取微生物群落总DNA，然后利用200μl的小枪头进行切割，将总DNA修剪成40-50Kb的随机的大片段；通过DNA的末端修饰使其末端成为两条链平齐的钝末端，利用DNA快速连接酶将DNA大片段与CopyControl pCC1FOS Vector质粒（Epicentre）连接起来构建重组的fosmid质粒；然后将重组的fosmid质粒转化到EPI300-T1^R Plating大肠杆菌感受态细胞（Epicentre）；将转化后的大肠杆菌细胞液均匀地涂布在含有氯霉素的LB培养基上，过夜培养，挑取阳性克隆子构成含有7776个克隆子的宏基因组文库；每个克隆子中都含有一段40-50Kb的插入DNA片段，

利用诱导剂诱导宏基因组文库中的克隆子，使重组fosmid质粒在细胞中的拷贝数达到至少50个，然后提取宏基因组文库中每个克隆子的fosmid质粒，用紫外吸收法测定质粒的浓度，调节浓度为50ng/μl储存；将10μl的fosmid DNA与40%的二甲基亚砜按体积1:1的比例混合，用芯片点样仪，在相对湿度为50-55%的条件下将fosmid DNA样品打印在硅化玻片表面；样品点之间的距离为250μm，打印好的芯片室温干燥过夜后紫外照射使核酸分子与玻片交联固定。

将探针在芯片上排列成18行36列的亚矩阵，共排列26个亚矩阵，每个探针在芯片上有2个阵列重复。

所述的酸性浸矿体系为江西德兴铜矿的酸性浸矿体系。

利用上述的宏基因组芯片筛选浸矿体系微生物群落中的新基因的方法，包括以下步骤：PCR扩增待筛选目标基因并进行荧光标记：将经标记后的PCR产物与宏基因组芯片杂交，获取阳性杂交信号数据，通过PCR验证，然后通过测序对应宏基因组文库中的克隆子得到目标基因的完整序列信息。

与传统方法相比，本发明芯片及方法能够快速的筛选目标基因，提高了基因文库的利用效率，避免了重复建库筛选文库利用率低的弊端。同时，这种方法不要求微生物必须是纯培养物，所以可以有效地筛选到未分离纯化微生物的新颖基因。

附图说明

图1为16sRNA基因宏基因组杂交结果；

图2为宏基因组芯片质粒浓度与信号关系；

图3为SAOR基因PCR扩增电泳图；

图4为SAOR不同基因型在群落中所占比例；

图5为SAOR基因宏基因组芯片扫描图；

图6为德兴铜矿浸矿水中的细菌微生物SAOR基因的系统发育树。

具体实施方式

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例1

宏基因组文库的制备