[发明专利]血清学H-Y抗原基因DBY抗体制备及其XY精子免疫分选法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种血清学H-Y抗原基因DBY重组抗原肽，及其血清学H-Y抗原基因DBY抗体制备和XY精子免疫分选法。

背景技术

雄性特异性弱组织相容性抗原（Male specific minor histompatibility antigens，H-Y抗原）最初发现是作为一种异性间移植抗原，为雄性动物特有的物质，在雄性个体中无组织和器官特异性。随着研究的深入，人们发现H-Y抗原是糖蛋白，存在于雄性哺乳动物细胞表面。H-Y抗体在哺乳动物性别鉴定和控制的理论和实践研究上具有重要意义，国内外多个实验室生产了H-Y抗原抗血清及单克隆抗体，并进行了胚胎的性别鉴定和控制，但由于其抗原的特异性较弱和复杂性，抗体实际应用效果不理想，未能在生产中得到广泛应用。

雄性传递偏移现象和性别偏移现象的发生证明了X和Y精子间存在非共享蛋白(Hendriksen et al.,1996),同时血清学H-Y抗原部分抗原表位的成功鉴定、X和Y精子免疫学分离实验结果以及Y精子特异性蛋白的检测结果都为X和Y精子膜蛋白差异的存在提供了间接的证据(Grant et al.,2008;Robbins et al.,2008;Zhang et al.,2008)。Blecher等（1999）用色谱柱得到相对保守的牛精子性别特异性蛋白(Sex specific proteins，SSPs)，研究发现SSPs抗体可引起约半数的牛精子凝集，未凝集精子体外受精，生产出90％以上雄性胚胎；Souza等(1999)纯化并产生了一个针对19kDa的牛精子膜蛋白的单克隆抗体，流式细胞仪分析显示结合约60％的精子，免疫组化仅有雄性组织被染色。然而，到目前为止，仍未见用上述法产生性别控制后代的实际应用研究报道。

利用H-Y抗原进行胚胎早期性别鉴定和精子的分离应用于生产研究。无论是应用免疫技术分离X精子与Y精子，还是进行胚胎的性别鉴定，都必须依赖高纯度、高效价的特异H-Y抗体。早期研究已分别采用雄性动物细胞免疫雌性动物的方法和单克隆抗体技术来制备H-Y抗体，但其特异性不强，且操作繁琐。H-Y抗体纯度低、效价不高，这些都限制了H-Y抗体的应用及H-Y抗原的研究。Y精子的血清学H-Y抗原是一弱自身组织抗原，这为H-Y抗原候选蛋白和抗体的筛选带来了挑战，借助基因序列信息和生物信息学技术来筛选血清学H-Y抗原的候选抗原表位，为血清学H-Y抗体的研究提供了新技术途径。

DBY基因为血清学H-Y抗原的候选基因之一，定位于Y染色体短臂末梢AZFa区域Xp11.3-11.23，含有17个外显子，编码660个氨基酸残基，为ATP依赖性RNA解螺旋酶，是DEAD-Box(天冬氨酸-谷氨酸-丙氨酸-天冬氨酸序列)RNA解旋酶基因家族成员之一。DBY的转录子仅在雄性胚胎细胞中检测到，在胚胎性腺发育17.5天DBY基因表达水平达到最高峰，出生后有所降低，但在成年雄性性腺中仍维持较低水平；可育小鼠精子中，DBYmRNA被选择性保留，并且在受精时通过反转录聚合酶链反应转移到卵子内，在雄性小鼠合子早期受精卵发育中起重要作用。同时DBY基因编码一个仅在睾丸中表达的短转录子，由此推断DBY在精子发生过程中起重要作用。

由于DBY基因与X染色体上的对应基因Dbx有较高的同源性，这为DBY特异性抗体的制备带来很大的难度。利用生物信息学方法分析DBY与DBX间的同源性，去掉高度同源序列区域，在序列差异区域选择DBY特异性抗原表位为特异性抗体的制备提供了新的思路。在本发明中我们通过选取具有代表性和应运广泛性的几个软件模型来研究DBY蛋白的线性B细胞表位，全面分析了DBY蛋白的生物特性。分别进行跨膜区分析和序列比对去除同源区，利用在线软件预测获得优选序列区域，最后用独立软件进一步筛选，综合评价得出抗原肽序列。小鼠DBY蛋白的空间构象相关信息还没有公布，而没有分析其构象表位，所以在DBY抗原肽筛选中我们选取了3段序列，用于下游实验抗原肽表达的参考。

发明内容

本发明的目的是提供一种DBY重组抗原肽，及其基于血清学H-Y抗原基因DBY的抗原表位抗体的制备方法和XY精子免疫分选法。

一种DBY重组抗原肽，包含以下三段蛋白序列：

DBY-Ⅰ

KSSDNQNGGGNTESKGRYIPPHLRNRETSKGVCDKDSSGWSCSKDKDAY

SSFGSRDSRGKPNYFSDRGSGSRGRFDDHGRNDYDGIGGRDRTGFGKFER

SGHSRWSDRSDEDDWSK