[发明专利]一种能够大规模并快速高纯度地诱导间充质干细胞转决定成造血干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是指一种能够大规模并快速高纯度地诱导间充质干细胞转决定成造血干细胞的方法。 

背景技术

脂肪源性干细胞（Adipose-derived stem cell，AD-MSCs）的主要来源白色脂肪（white adipose tissue，WAT）在体内分布广泛，储量丰富。细胞克隆实验证明，骨髓来源的间充质干细胞（Bone-marrow mesenchymal stem cell，BMSCs）仅占成人骨髓的0.2×10^-5-0.1×10^-5，而脂肪组织中所获得的干细胞克隆形成率是BMSCs的100-500倍。骨髓中BMSCs的比例和增值能力均会随着年龄的增长和骨质疏松的发生率而下降，但脂肪组织中ADSCs数量不随供者年龄增加而减少。ADSC体外扩增和自我更新能力强，原代培养约5-7天后，细胞融合超过90%，一个月出现3个对数生长期，能较稳定传代20代以上；体外培养时对血清无特殊选择性，无需添加物即可良好的生长，液氮冻存和长期传代后的ADSCs细胞生长和表型均无改变。 

ADSCs具有多向分化能力，在不同诱导培养条件下，ADSCs能够定向分化成成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、胰腺内分泌样细胞、肝脏细胞和视神经细胞等多种组织细胞。但至今不清楚它们是否能转化为造血干细胞（HSCs）。 

造血干细胞是治疗血液病尤其是白血病的最有效方法。白血病和其它肿瘤疾病一样，近年来在中国有着显著增长的趋势，并呈现低龄化的特点。白血病占恶性肿瘤的5%，发病以儿童和青年居多。治疗白血病的最有效的方法就是造血干细胞治疗。但目前的治疗手段是通过寻找配型的骨髓或造血干细胞，患者家属以及社会的相关部门动用一切可调动的资源寻找配型适合的造血干细胞，能配上的微乎其微。因此催生了国家干细胞库的设立，但每个库通常要花费2亿元左右，其经济成本之高可想而知，但从技术上乃不能完全排除免疫排斥和致瘤可能。此外，由于干细胞的数量有限，无分化扩增技术的缺少，使最终优 质的医疗结果得不到保证。上述种种原因急需人们去发现新的产生造血干细胞的来源和研制新的无分化扩增造血干细胞的技术和方法。 

近年来的研究发现不同类型的造血细胞中小RNA的表达显著不同，而且这种不同在细胞的发育过程中起着重要的调节作用。例如，miR-181和B-淋巴细胞的发育有关，miR-142和miR-223与T-淋巴细胞的发育有关，miR-221和miR-222与人的红细胞生成有关，miR-223和小鼠的粒细胞分化相关，而miR-10,miR-126和miR-17与巨核细胞减少有关。除此之外，人们还发现某些小RNA，如miR-128和miR-181，能起到阻止造血干细胞分化的作用。尽管已经发现某些miRNA，例如miR-130a和miR-10a，通过作用HOXA1基因和MAFB基因的转录因子基因从而诱导细胞分化。 

发明内容

本发明提出一种能够大规模并快速高纯度地诱导间充质干细胞转决定成造血干细胞的方法，解决了现有技术造血干细胞治疗中的细胞配型困难、免疫排斥和造血干细胞数量限制的技术瓶径的问题。 

本发明的技术方案是这样实现的：一种能够大规模并快速高纯度地诱导间充质干细胞转决定成造血干细胞的方法，包括下列步骤： 

1）制备均质的间充质干细胞的培养基； 

2）多种小RNA分子的组合； 

3）核酸多肽纳米粒的组装和转染； 

4）转决定后的造血干细胞诱导扩增培养基； 

5）激活多种造血相关的基因。 

作为优选的技术方案，所述培养基是指在无血清的高糖DMEM/F12培养基中添的EGF，FGF-2,lPDGF，IGF和TGF-β五因子。 

作为优选的技术方案，所述培养基是指在无血清的高糖DMEM/F12培养基中添的shh，SCF，TPO，Flt3L，Delta1，IGFBP，Angiopoietin，MBP4，LIF，TGF-β十因子。 

作为优选的技术方案，所述多种小RNA分子是指miR-138-1，miR-138-2，miR-433以及靶向EID1mRNA不同位点的siR-EID1分子的序列。 

所述靶向EID1mRNA不同位点的siR-EID1分子的序列见表2。 

作为优选的技术方案，所述转决定后的造血干细胞培养是指在造血干细胞 诱导扩增培养基中以5×10⁵/ml的细胞密度进行培养至少3天。