[发明专利]一种铁皮石斛无糖组织培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种铁皮石斛无糖组织培养方法，属于农业技术领域。

背景技术

 铁皮石斛，为兰科多年生附生草本植物。生于海拔达1600米的山地半阴湿的岩石上，喜温暖湿润气候和半阴半阳的环境，不耐寒。一般均能耐－5℃的低温。石斛可分为黄草、金钗、马鞭等数十种，铁皮石斛和金钗石斛为石斛之极品，铁皮石斛因表皮呈铁绿色而得名。铁皮石斛具有独特的药用价值，以其茎入药，中药名：石斛，属补益药中的补阴药，《中国药典》：益胃生津，滋阴清热。铁皮石斛等少数品种之嫩茎，扭成螺旋状或弹簧状，晒干，商品称为耳环石斛，又名枫斗。多年以来，商品石斛主要依靠野生药用石斛资源，随着药用石斛开发利用的不断深入和国内外需求量的逐年增加，我国野生药用石斛资源遭到了严重破坏，有些地区甚至面临枯竭。为了保护野生兰科植物资源，各国都出台了许多禁止采挖或销售野生兰科植物的法规和条例，如1975年生效的《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES），把所有兰科植物全部列入附录Ⅰ和Ⅱ中；于1987年国务院出台的《野生药材资源保护管理条例》中，环草石斛、黄草石斛、金钗石斛、马鞭石斛和铁皮石斛被列为国家三级珍稀濒危保护植物。这些政策措施对野生药用石斛资源的妥善保护起到了重要作用。传统铁皮石斛组织培养小植株主要依靠培养基中的糖作为碳源，极易引起微生物的污染。为了减少微生物的污染，必须使用封闭的、小的培养容器。培养容器小，并且由于培养基中糖的存在，导致叶片表层结构发育差，气孔开闭功能不强，叶片小，叶绿素含量低，最终抑制和降低了小植株的光合作用能力。与植株自然生长差异悬殊的容器内环境，还导致植株生理、形态上的一定紊乱，难以适应的会生长发育延缓或死亡，有的会出现植株生长细弱，叶片舒展度差，生根不良，引起驯化阶段植株较高的死亡率，为此必须使用植物生长调节剂，但是植物生长调节剂的使用又会导致畸形和变异。

发明内容

本发明的目的是提供一种铁皮石斛无糖组织培养方法，可解决传统组培过程中污染率高、生根率低、品质差的问题，可提高铁皮石斛组培苗的质量和产苗率，缩短培养周期，并且降低组培苗生产成本。

本发明的目的是这样实现的：

本发明的铁皮石斛无糖组织培养方法包括以下步骤：

（1）外植体准备：选择典型性状健康的铁皮石斛种苗的茎，以茎芽为中心上下各留0.5cm剪下茎段作为体皮石斛无糖组织培养的外植体，将外植体浸泡在酒精体积百分含量70％的烧杯中2分钟进行灭菌，然后用无菌水冲洗l 次；

（2）初代无糖组织培养：将经步骤（1）处理的外植体接种至铁皮石斛无糖组织培养初代培养基中，置于不锈钢外壳植物生长箱进行初代培养；

（3）无根苗筛选：将经过步骤（2）培养的无根苗进行筛选，选择大小达3 - 4cm 的无根苗并用无菌水冲洗，将冲洗干净的无根苗切割为单苗；

（4）继代无糖组织培养：将经步骤（3）处理的单苗接种至铁皮石斛无糖组织培养继代培养基中，置于不锈钢外壳植物生长箱进行继代培养。

在步骤（2）所述铁皮石斛无糖组织培养初代培养基中，a-萘乙酸的含量为0.1—0.5mg/L， 6-苄氨基腺嘌呤的含量为1—3mg/L，香蕉汁的含量为80—120g/L，活性炭的含量为200—300mg / L ，0.25毫米的沙粒的含量为8—10g/L，PH为5.6。

在步骤（2）所述的初代无糖组织培养中，培养周期20—40天，CO₂浓度650±50μL/L，培养温度20℃—26℃，光照强度1800—2100Lx，光照时间16—20小时/天。

在步骤（4）所述铁皮石斛无糖组织培养继代培养基中，6-苄氨基腺嘌呤的含量为1—3mg/L，香蕉汁的含量为80—120g/L，活性炭的含量为300—600mg / L， 0.25毫米的沙粒的含量为8—10g/L， PH为5.6。

在步骤（4）所述的继代无糖组织培养中，培养周期30—60天，CO₂浓度650±50μL/L，培养温度20℃—26℃，光照强度1800—2100Lx，光照时间16—20小时/天。

本发明的这种铁皮石斛无糖组织培养方法与传统铁皮石斛组织培养方法区别在于：