[发明专利]一种抗癌药物的新型筛选方法

权利要求书

1.一种抗癌药物的新型筛选方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)TTLL12过表达Hep-2细胞株的制备

自行设计引物，正义链5’-CGGGATCCCCGATGGACTACCACGAGGA-3’，反义链5’-CGGGATCCTAGCTACAGGACGCCCCCG-3’，以TTLL12cDNA为模板扩增TTLL12基因片段，获得目的基因片段的大小为2818bp，再将TTLL12基因片段插入pSG-5质粒中，然后将重组质粒用化学方法分别转化大肠杆菌JM109，再将重组质粒转染Hep-2细胞，挑选出个别表达TTLL12的克隆，继续培养，经多次传代培养，最后获得稳定过表达TTLL12的Hep-2细胞株；

(2)阳性对照和阴性对照药物的选用

将100uM紫杉醇和噻丙稀分别与稳定过表达TTLL12的Hep-2细胞株于含硝基化酪氨酸的培养液中进行培养，然后行western试验，结果可知紫杉醇能增加硝基化酪氨酸微管蛋白，具有抑制TTLL12功能的作用，可作为阳性对照；而噻丙烯不能促使硝基化酪氨酸微管蛋白的形成，不具有抑制TTLL12功能的作用，可作为阴性对照；

(3)硝基化酪氨酸最适浓度和待测药物最适稀释浓度的获得

将TTLL12过表达Hep-2细胞株以每孔10000个，接种到96孔板内，MEM培养液体积为80μL，在于37℃，5％CO₂培养箱内，培养6小时，分别加入终浓度为50μM，100μM，200μM，400μM，800μM硝基化酪氨酸，每孔共10μL，由于Elisa较western敏感，因此紫杉醇和噻丙烯的用量均小于100μM，分别加入终浓度为5μM，10μM，20μM，40μM等4个稀释度，每孔共10μL，与硝基化酪氨酸不同稀释度进行方阵滴定，继续在37℃，5％CO₂培养箱内，培养24小时之后，吸出96孔板孔内培养液，每孔加入100μL细胞骨架隔离缓冲液，培养3分钟，然后去除缓冲液，每孔加入100μL含有3.7％甲醛和0.05％Tween-20的PBS固定10分钟，然后去除固定液，每孔加入100μL PBS稀释的辣根过氧化物酶标记硝基化酪氨酸抗体1∶1000，在室温下与细胞作用1小时，然后去除抗体溶液，用含有0.05％Tween-20的PBS 200μL冲洗小孔，然后加100μL的OPD-H₂O₂显色3分钟，各孔加入50μL的2moL/L H₂SO₄终止反应，利用检测仪在450nm处读数，最后得到硝基化酪氨酸的最适浓度为400μM，待测药物最适稀释浓度为10μM；

(4)筛选药物

将TTLL12过表达Hep-2细胞株以每孔10000个，接种到96孔板内，每孔MEM培养液体积为80μL，在于37℃，5％CO₂培养箱内，培养6小时，分别加入终浓度为400μM硝基化酪氨酸，每孔共10μL，待测药物和紫杉醇的终浓度均为10μM，每孔共10μL，待测药物和紫杉醇均重复6孔，继续在37℃，5％CO₂培养箱内，培养24小时.之后，吸出96孔板孔内培养液，加入每孔100μL细胞骨架隔离缓冲液，培养3分钟，去除缓冲液，每孔加入100μL含有3.7％甲醛和0.05％Tween-20的PBS固定10分钟，然后去除固定液，每孔加入100μLPBS稀释的辣根过氧化物酶标记硝基化酪氨酸抗体1∶1000，在室温下与细胞作用1小时，然后去除抗体溶液，用含有0.05％Tween-20的PBS200μL冲洗小孔，然后加100μL的OPD-H₂O₂显色3分钟，各孔加入50μL的2moL/L H₂SO₄终止反应，利用检测仪在450nm处读数，最后进行比较，若OD450nm值大于1，则说明该药物具有抗癌作用，并具有抑制TTLL12的功能，促进硝基化酪氨酸与α-tubulin的结合，通过参与微管蛋白修饰的机制，形成较多的硝基化酪氨酸微管蛋白，导致癌细胞死亡的抑癌作用机理；反之则不具有上述抑癌作用机理。

2.根据权利要求1所述一种抗癌药物的新型筛选方法，其特征在于：所述细胞骨架隔离缓冲液由90mM的Mes pH6.7、1mM的EGTA、1mM的MgCl₂、10％glycerol和0.5％Triton X-100配制而成。