[发明专利]一种基于连接酶反应的多特异位点DNA甲基化电化学检测方法

权利要求书

1.一种多特异性位点DNA甲基化检测方法，包括如下步骤：

（1）根据目标DNA序列上的每个特异性甲基化位点的侧翼序列设计一组核酸探针，每组核酸探针由一条分离探针和一条信号探针组成，分离探针用固相载体修饰，信号探针用量子点修饰，检测不同甲基化位点所使用的信号探针上修饰的量子点不同；

（2）目标DNA样品用重亚硫酸盐处理，使未被甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶；

（3）将分离探针和信号探针加入步骤（2）处理后的目标DNA溶液中进行杂交；

（4）收集固相载体，清洗后加入DNA连接酶反应液进行连接反应，反应结束后进行解链反应，解链结束后，趁热将固相载体与反应液分离；

（5）收集固相载体，清洗后利用溶出伏安法测定固相载体上连接的量子点的电化学信号；

（6）根据电化学信号的归属和强度确定甲基化的位点和甲基化程度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分离探针的长度为35～45 bp， 信号探针的长度为10～15 bp。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相载体为磁性微球、聚四氟乙烯微球、金片、或表面修饰有羧基或氨基的微米材料。

4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述分离探针的制备方法如下：固相载体分别用100 mM咪唑缓冲溶液和EDC/NHS溶液处理后，加入核酸分子，35～45℃下振荡反应1～3小时，分离，分别用2×SSC缓冲溶液（0.5% SDS）和65℃高纯水清洗，得到分离探针。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述信号探针的制备方法如下：量子点水溶液与核酸分子混合，在N₂保护下搅拌16～24小时，逐滴加入PBS（pH 7.4，0.24 M NaCl，0.1% NaN₃）后在PBS（pH 7.4，0.2 M NaCl）中透析36～48小时，离心收集制备的信号探针。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述杂交的条件为：35～45℃下杂交1～3小时。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）所述连接酶反应液的组成为：30 mM Tris-HCl，4 mM MgCl₂，10 mM (NH₄)₂SO₄，0.005% BSA，0.2 mM NAD和0.5 U/L Ecoli DNA连接酶。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）所述连接反应的条件为：35～40℃下反应1～2小时。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）所述解链的条件为：85～95℃下解链5～15分钟。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5）测定溶出伏安曲线的条件为：玻碳电极在300～500μg/L铋溶液中，－0.9～－1.1 V沉积10分钟。