[发明专利]一种基于连接酶反应的多特异位点DNA甲基化电化学检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种DNA甲基化测定分析方法，具体涉及一种基于连接酶反应的多特异位点DNA甲基化电化学检测方法。 

背景技术

DNA甲基化是一种广泛存在于高等生物的重要基因表观遗传修饰方式，也是外遗传体系的一种重要表达调控机制。DNA 甲基化主要发生在5’-CpG-3’的 C，生成5-甲基胞嘧啶（5-mC）。大量研究表明，DNA甲基化是在不改变基因碱基序列的情况下，通过改变CpG岛的甲基化程度，在转录水平上实现调控基因表达，消除潜在危险DNA序列，调节发育过程和各种生理反应等功能。相反，DNA低甲基化和CpG岛高甲基化等异常的基因组甲基化，不仅会导致DNA复制延迟、染色体压缩、转录抑制等，而且会影响疾病的易感性、发生发展、预后和转归等。近年发现，基因组DNA异常甲基化与多种疾病尤其是年龄相关的慢性疾病的发生密切相关。由于DNA甲基化在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，建立准确度高、操作简单的DNA甲基化检测方法，对疾病的早期诊治和社区干预等具有十分重要的理论意义和实用价值。 

DNA甲基化的检测研究可分为三个层次：（1）基因组整体甲基化水平检测，（2）特异位点甲基化水平检测，（3）新甲基化位点的寻找。常规的DNA甲基化的检测方法主要依赖甲基化敏感性内切酶在各自识别位点对5-mC和C不同的敏感性进行区分，或重亚硫酸盐对甲基化和非甲基化胞嘧啶的化学活性不同使DNA包含的甲基化信息转变为序列的差异信息。方法主要包括甲基化结合蛋白柱层层析，MSssI甲基转移酶分析和氯乙醛反应法，甲基化特异性PCR（MSP），甲基化敏感性单链构象分析，重亚硫酸氢钠联合限制性内切酶分析法（COBRA），甲基化敏感性斑点分析，甲基化敏感性变性梯度凝胶电泳，甲基化敏感单核苷酸引物延伸法（MS-SNuPE），PCR荧光变性曲线分析，变性高效液相色谱法（DHPLC），甲基化荧光检测（MethyLight），甲基化特异性多连接依赖性探针扩增（MS-MLPA），DNA甲基化微阵列芯片技术等。虽然甲基化检测方法得到很大发展，但各种方法存在着明显的限制性。重亚硫酸盐法要求大量的克隆测序，过程繁琐、昂贵，同时处理不完全时容易导致假阳性；甲基化敏感性单核苷酸引物衍生技术则存在着实验步骤略复杂，若要检测多个位点时，需要设计多个引物和存在放射性污染及重亚硫酸盐处理不完全的问题；甲基化敏感性链解曲线分析技术等则存在着灵敏度太低的缺点；依赖基因测序或多步的PCR扩增使分析步骤复杂，检测需时长，测定成本高；使用限制性内切酶只能获得特殊酶切位点的甲基化水平，不能确定样品DNA中其它位点的甲基化情况。因此，需要寻找更加简单、快速的方法。 

电化学方法具有快速，灵敏，不受溶液浊度影响，且仪器简单、操作方便，使用成本低，无需复杂的前处理过程，易于微型化和实现现场检测等特点，在DNA甲基化检测方面具有独特优势。近年来，DNA甲基化的电化学检测方法取得了一定的突破，但从文献报道来看，DNA甲基化的电化学检测主要集中在DNA整体甲基化水平的检测，对特异位点的甲基化水平检测和新位点寻找的电化学方法鲜有报道。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于连接酶反应的多特异位点DNA甲基化电化学检测方法。 

本发明所采取的技术方案是： 

一种多特异性位点DNA甲基化检测方法，包括如下步骤：

（1）根据目标DNA序列上的每个特异性甲基化位点的侧翼序列设计一组核酸探针，每组核酸探针由一条分离探针和一条信号探针组成，分离探针用固相载体修饰，信号探针用量子点修饰，检测不同甲基化位点所使用的信号探针上修饰的量子点不同；

（2）目标DNA样品用重亚硫酸盐处理，使未被甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶；

（3）将分离探针和信号探针加入步骤（2）处理后的目标DNA溶液中进行杂交；

（4）收集固相载体，清洗后加入DNA连接酶反应液进行连接反应，反应结束后进行解链反应，解链结束后，趁热将固相载体与反应液分离；

（5）收集固相载体，清洗后利用溶出伏安法测定固相载体上连接的量子点的电化学信号；

（6）根据电化学信号的归属和强度确定甲基化的位点和甲基化程度。

所述分离探针的长度为35～45 bp，信号探针的长度为10～15 bp，以保证杂交的选择性。 

所述固相载体为磁性微球、聚四氟乙烯微球、金片、或表面修饰有羧基或氨基的微米材料。