[发明专利]荧光探针杂交法检测人EGFR基因突变试剂盒

权利要求书

1.一种人类EGFR基因突变的检测方法和试剂盒，其特征在于多重不对称PCR扩增，PNA/LNA探针作为阻滞探针，荧光杂交探针溶解曲线判断结果、以及包括固体形式存在的1xPCR反应物（由引物混合物、tris-cl、Kcl、MgCl₂ 、热启动聚合酶、UNG酶和冻干保护剂组成）、其特殊之处在于：

a：特殊的三段式引物，其三段式引物设计及后继的扩增为独创的MAP（多重单链PCR扩增）技术，其序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3 、SEQ ID NO.4 、SEQ ID NO.5 、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7 、SEQ ID NO.8 ；

b：特殊的探针，所选取的4个探针具有良好的特异性和保守性，可以根据Tm值的变化来判断突变，分别为SEQ ID NO.17，SEQ ID NO.18，SEQ ID NO.19，SEQ ID NO. 20；

c：特殊的存储条件:本试剂盒为PCR反应物提供了固体形式的存储方式；

d：反应条件通过优化，大致分为两个阶段，其中第一阶段为富集阶段，本阶段使用浓度极低的3个引物和一个过量的正向引物，反应温度一般为50℃左右，扩增阶段低浓度引物将被消耗完，随后第二阶段仅有负向引物工作，随着扩增的进行，将产生大量的单链目的核苷酸序列；

e：特殊的阻滞探针，本试剂盒使用了特殊的PNA阻滞探针来屏蔽19号外显子野生型基因的表达，大大提高了诊断的准确性。

2.权利要求1所述试剂盒，引物扩增策略为二轮扩增，分为双链对称扩增阶段和单链不对称扩增阶段。

3.权利要求1中的试剂盒，其冻干保护剂成分由海藻糖，甘油和粘合剂组成。

4.权利要求1中的试剂盒，其PCR产物的检测方法为荧光探针杂交、斑点杂交，反向斑点杂交、液相杂交平台。

5.权利1中所述的试剂盒，其用途用于检测人类EGFR基因的突变。