[发明专利]荧光探针杂交法检测人EGFR基因突变试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术和医学领域，具体涉及一种使用杂交探针检测EGFR 基因突变位点的试剂盒。 

背景技术

非小细胞肺癌（NSCLC）在世界范围内相当普遍，是造成男女个体因癌症死亡的最重要的原因，化学疗法对于治疗NSCLC显得无能为力，大约有85%的病人疗效不显著，在此情况下，分子靶向药物作为新的疗法受到关注。表皮生长因子受体（EGFR）是一种酪氨酸蛋白激酶，在许多肿瘤中过表达和(或)发生突变，通过信号转导控制肿瘤生长，并与新生血管生成、肿瘤的侵袭和转移等有密切的关系。在非小细胞肺癌中，EGFR往往过量表达，然而，EGFR的表达多少并不能成为预测药物反应的一个有效指标，研究证实EGFR的突变对于药物反应十分重要，不同外显子的突变将导致构象变化，改变和增强蛋白的活性，同样增强对TKI的敏感性，易瑞沙和特罗凯作为分子靶向治疗药物被美国FDA批准使用，对10%~15%的病人有显著疗效。KI通过与ATP竞争结合EGFR胞内酪氨酸激酶区，阻止酪氨酸残基磷酸化，从而阻止EGFR信号通路的传导，最终达到抑制肿瘤增殖、转移、血管生成等一系列肿瘤细胞生物活动。通过检测肺腺癌患者EGFR的突变情况，以及与临床特征之间的关系，可以筛选最合适的病人进行有针对性的靶向治疗提供依据，以避免不合理用药。 

目前普遍应用的EGFR 基因突变检测方法为限制小片段长度多态性分析法（RFLP法）和DNA 直接测序，Taqman水解探针检测等。RFLP 法是将PCR 与限制性酶切相结合的方法。但是该方法存在以下缺点：RFLP 实验操作繁琐，检测周期长，成本高昂，存在第一轮酶切不完全导致的假阳性，非闭管操作，易于污染，难以满足临床检测要求。DNA 直接测序的原理是：该方法存在以下缺点检测周期较长，花费昂贵，非闭管操作，难以避免交叉污染，通量不高。DNA 直接测序的灵敏度较低，杂合突变、GC 富集区的存在等问题使得很难通过一次测序获得精确的数据，需要多次重复测序才可能避免假阳性等，因此直接测序方法难适用于临床检测。 

Taqman水解探针法使用扩增阻滞突变系统（amplification refractory mutation system，ARMS）与荧光探针结合来检测突变，理论上根据PCR 扩增时使用的Taq DNA不能修正引物3’端碱基错配，只要引物3’端与模板1 个碱基不配对，便无法扩增出特异性产物。针对这种特性设计引物，使得突变型得到扩增，野生型无法扩增，从而放大了突变型信号，便于检测。利用ARMS 引物对突变靶序列进行PCR 扩增，Taqman探针对扩增产物进行特异性位点检测，在Real-time PCR 基础上鉴定特定突变。该方法存在缺陷：ARMS技术引物最后一个碱基不匹配并不能完全阻滞野生型DNA的扩增，所以这种方法存在假阳性的风险，而且taqman结合arms检测EGFR需要分管操作，这样待测dna需要达到一定的量，而且操作麻烦。 

Taqman探针一般作为水解探针使用，这样在单个突变位点检测中使用较为广发，但是涉及到多重突变检测，则检测位点个数受到通道限制。Taqmen探针作为杂交探针鲜见有人提起，一般认为Taqman探针在自由状态及结合到模板时不发光，仅在核酸酶水解探针时才发光。而经过我们研究证实，taqman探针在自由状态荧光值很低，而在结合到模板时，由于双链的螺旋结构而处于直线状态，这样激发基团和淬灭基团由于相距一定的距离，而使激发基团发出的光不被完全淬灭，而这种特性使taqman探针可以作为杂交探针使用。 

多重不对称PCR(multiplex asymmetric pcr, MAP)对多个靶点进行不对称扩增，扩增产物可以直接用于杂交而不需要经过单链分离过程，MAP包括特殊的引物设计方法，这种引物设计使不同的引物具有较宽泛的退火温度，这样是多引物扩增时退火温度归一化，极大的增加了多位点同时扩增的成功率。目前多重不对称PCR用于荧光平台未见专利报道。 

肽核酸(Peptide Nucleic Acid,PNA)是近十几年发展起来的以中性酰胺键为骨架的脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid,DNA)类似物,其结构介于多肽和DNA之间。PNA可以特异性地与DNA或RNA杂交，形成稳定的复合体。PNA由于其自身的特点可以对DNA复制、基因转录、翻译等进行有针对的调控，同时作为杂交探针大大提高了遗传学检测和医疗诊断的效率和灵敏度。由于PNA能够与DNA和RNA特异性地结合,可以制备PNA探针.与DNA探针相比,其杂交的稳定性和特异性大大增加。 

发明内容