[发明专利]尖孢镰刀菌苦瓜专化型的分子标记及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子标记技术领域，尤其涉及尖孢镰刀菌苦瓜专化型的分子标记及其应用，具体是尖孢镰刀菌苦瓜专化型的RAPD标记和由该标记转化得到的SCAR标记以及这些分子标记在病原菌鉴别及发病组织检测中的应用。 

背景技术

由尖孢镰刀菌苦瓜专化型(Fusarium oxysporum Schl.f.sp.Momordicae Sun & Huang,FOM)引起的苦瓜枯萎病是一种危害严重的真菌性病害，该病害已遍及亚洲苦瓜主产区如菲律宾、日本、印度等国家，在我国广西、广东、湖南、福建、浙江、江西和台湾等省（区）发生严重，造成苦瓜产量的巨大损失。尖孢镰刀菌苦瓜专化型与引起葫芦科瓜类作物枯萎病的其他6个已知尖孢镰刀菌专化型病原菌在表型上非常接近而难以辨别，主要依赖于对特殊寄主的致病性或较窄的寄主范围来区分和鉴定，这一传统接种鉴定方法周期较长，耗时费力。 

分子标记技术已被广泛用于植物病原真菌种内、种间和属间亲缘关系的研究，为鉴定和检测病原菌提供了基础。利用随机扩增多态性DNA（RandomAmplified Polymorphic DNA,RAPD)指纹图谱丰富的信息量，寻找专一性DNA序列标签(Sequence Tagged Sites,STS)制作特异探针或转换成更加稳定的序列特异扩增区域标记(Sequence Characterized Amplified Region,SCAR)，可以简化传统的鉴定技术，被成功地应用在多种植物病原真菌的病原鉴定和诊断中,如香蕉枯萎病生理小种、尖孢镰刀菌菠菜专化型、黄瓜专化型和丝瓜专化型等(廖林凤等,2009;Jiang,2006;Wang等,2001;Bart等,2007)。这充分说明了利用分子标记技术将有可能成为鉴别和检测葫芦科瓜类作物枯萎病致病菌的尖孢镰刀菌各专化型的有力武器。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供特异专一的尖孢镰刀菌苦瓜专化型的分子标记RAPD标记和SCAR标记及其在病原菌鉴别及发病组织检测中的应用。 

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：尖孢镰刀菌苦瓜专化型的RAPD标记S58_-519，具有序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列。 

上述尖孢镰刀菌苦瓜专化型的RAPD标记S58_-519在病原菌鉴别及发病组织检测中的应用。 

尖孢镰刀菌苦瓜专化型的SCAR标记SCAS58_-519，具有序列表SEQ.ID.No.2的碱基序列。 

扩增SCAS58_-519标记的引物对具有序列表SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.4的碱基序列。 

上述尖孢镰刀菌苦瓜专化型的SCAR标记SCAS58_-519在病原菌鉴别及发病组织检测中的应用。 

尖孢镰刀菌苦瓜专化型PCR快速检测方法，PCR反应体系中含有序列表SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.4的碱基序列的引物对Primer1和Primer2。 

该检测方法PCR反应的反应体系和扩增程序分别为： 

反应体系共25μL：12.5μL2×Es Taq MasterMix，内含2×Es Taq PCR Buffer、3mM MgCl₂，Es Taq Polymerase和400μM dNTP Mix；1.0μL浓度10μmol·L^-1的Primer1，1.0μL浓度10μmol·L^-1的Primer2；2.0μL浓度15ng/μL的模板DNA，8.5μLddH₂O； 

扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存备用。