[发明专利]一种判定微管相关蛋白1轻链3蛋白斑点类型的方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞成像技术领域，具体涉及一种判定微管相关蛋白1轻链3蛋白斑点类型的方法。

背景技术

在自吞噬研究领域，经常需要表征细胞内自吞噬结构。微管相关蛋白1轻链3（LC3）蛋白被认为是一种自吞噬结构的标记性蛋白。通常将荧光（FP）蛋白与LC3融合表达于哺乳动物细胞，以便应用荧光显微镜动态观察自吞噬结构的形成与动态变化。在荧光显微成像中，可见均匀分布于胞浆和细胞核的荧光蛋白-微管相关蛋白1轻链3蛋白（FP-LC3）分子或分布于胞浆中的斑点状的结构，后者主要代表自吞噬结构。

但是，近5年的最新研究结果表明，这些FP-LC3斑点结构并不一定代表自吞噬囊泡结构，也可能代表LC3分子参与的蛋白聚集体（不含膜成分）。有研究表明，LC3的突变体LC3G120A(LC3□G)可以仅标记蛋白聚集体而不标记自吞噬囊泡结构，因此发展出了利用FP-LC3G120A(FP-LC3□G)来作为自吞噬结构的一个阴性对照。然而，现有的研究结果显示，虽然在特定条件下FP-LC3G120A(FP-LC3□G)确实主要标记蛋白聚集体而不标记自吞噬结构，但是在某些情况下FP-LC3G120A(FP-LC3□G)仍然会进入自吞噬囊泡，从而标记自吞噬结构。这表明，FP-LC3G120A(FP-LC3□G)并非一个完美的区分自吞噬结构或者蛋白聚集体的工具。

因此，发展出一种判定LC3斑点类型的方法，在活细胞内快速鉴别自吞噬结构与蛋白聚集体，对于提升生物学研究的准确性具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种准确、快速判定LC3斑点类型的方法。

本发明所采用的技术方案是：

一种判定微管相关蛋白1轻链3蛋白斑点类型的方法，包括以下步骤：

（1）将荧光蛋白（FP）与微管相关蛋白1轻链3（LC3）蛋白融合，转染并表达于哺乳动物细胞中；

（2）对步骤（1）得到的哺乳动物细胞进行处理，使哺乳动物细胞内形成荧光蛋白-微管相关蛋白1轻链3蛋白（FP-LC3）斑点；

（3）对步骤（2）得到的FP-LC3斑点进行分析，若FP-LC3与哺乳动物细胞胞浆中的FP-LC3存在完全、快速的交换行为，则FP-LC3斑点的类型为蛋白聚集体；若FP-LC3与哺乳动物细胞胞浆中的FP-LC3存在少量或者不存在交换行为，则FP-LC3斑点的类型为自吞噬结构。

优选地，所述步骤（3）中，分析方法为荧光漂白后恢复（FRAP）方法。

进一步地，所述FRAP方法为：对FP-LC3斑点进行FRAP分析，如果检测FP-LC3斑点的荧光信号的半恢复时间<1s，恢复程度>80%，则表明该FP-LC3斑点是蛋白聚集体。

优选地，所述步骤（3）中，分析方法为荧光激活后重分布（FRAPa）方法。

进一步地，所述FRAPa方法为：对FP-LC3斑点进行FRAPa分析，如果检测FP-LC3斑点的荧光信号的半衰减时间<2s，衰减程度>60%，则表明该FP-LC3斑点是蛋白聚集体。

优选地，所述步骤（3）是利用荧光显微镜进行观察。

本发明具有以下优点：

本发明是一种判定LC3斑点类型的方法，该方法的关键在于，观测FP-LC3与哺乳动物细胞胞浆中的FP-LC3是否存在完全、快速的交换行为，如果存在，则表明FP-LC3斑点的类型为蛋白聚集体；若FP-LC3与哺乳动物细胞胞浆中的FP-LC3存在少量或者不存在交换行为，则表明FP-LC3斑点的类型为自吞噬结构。利用本方法可以准确、快速地在活细胞内判定LC3斑点是自吞噬结构还是蛋白聚集体，判定的准确率达到100%，对提升生物学研究的准确性具有重要的应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例1中用FRAPa技术判定puromcyin诱导的dendra2-LC3斑点类型的图；

图2为本发明实施例2中阴性对照组(未处理组)的图；

图3为本发明实施例2中CQ诱导GFP-LC3/mCherry-LC3G120A斑点的图；

图4为本发明实施例2中rapamycin诱导GFP-LC3/mCherry-LC3G120A斑点的图；

图5为本发明实施例2中阴性对照组中细胞内平均GFP-LC3/mCherry-LC3G120A斑点的统计的图；

图6为本发明实施例2中CQ处理组中细胞内平均GFP-LC3/mCherry-LC3G120A斑点的统计的图；