[发明专利]一种共表达葡萄糖淀粉酶和α-淀粉酶的重组毕赤酵母菌株及其构建方法，以及混合酶制剂

说明书

技术领域

本发明涉及生物领域，具体涉及一种共表达葡萄糖淀粉酶和α-淀粉酶的重组毕赤酵母菌株及其构建方法，以及一种由该重组毕赤酵母菌株制备的混合酶制剂。 

技术背景

淀粉作为植物的重要贮藏物质，是世界上含量最丰富的物质之一。淀粉酶是指能够水解淀粉生成低分子量多聚糖或者单糖的一类糖苷酶。淀粉酶广泛应用于淀粉水解或者其发酵工业，比如乙醇生产、淀粉糖生产、啤酒酿造等。当前工业应用中最重要的淀粉酶有葡萄糖淀粉酶、α-淀粉酶、普鲁兰酶等。 

葡萄糖淀粉酶(EC3.2.1.3)，又称糖化酶，是一种外切酶，作用于麦芽寡糖的非还原末端，切割α-1,4糖苷键生成葡萄糖；同时也可以作用于α-1,6糖苷键，但水解速率远远低于水解α-1,4糖苷键的速率。α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)，又称液化酶，作用于淀粉、糖原以及其他多糖类物质，以随机的方式水解分子内的α-1,4糖苷键，产生麦芽寡糖和少量葡萄糖。由于α-淀粉酶水解淀粉形成更多的非还原末端，为葡萄糖淀粉酶作用提供更多底物，因此两者在水解淀粉过程中存在协同作用，可以促进葡萄糖的生成。 

淀粉水解工业中的许多步骤，比如淀粉糖化、麦芽糖的生产，在温度稍高的条件下操作显然更具有优势，比如更高的反应速率，较低的染菌风险等。但是当前广泛应用的糖化酶和液化酶普遍存在高温条件不稳定易失活的缺陷，因此使得生产成本大大增加。虽然也有很多研究报道通过菌种筛选寻找新型耐热葡萄糖淀粉酶和α-淀粉酶，以及采用基因克隆技术进一步获得其表达基因，但是迄今为止都很少有新型耐热葡萄糖淀粉酶或者α-淀粉酶真正用于产业化，主要是因为大多数新型酶都存在要么活力太低要么表达水平过低的缺陷。随着越来越多的高效异源表达系统被开发，通过异源表达以提高新 型葡萄糖淀粉酶或者α-淀粉酶的表达水平，成为耐热新型酶制剂产业化应用的有效方法之一。 

虽然现有技术中也有报道公开将黑曲霉葡萄糖淀粉酶和大麦α-淀粉酶同时表达在酿酒酵母中，但是这种研究却是为了赋予该菌种以直接降解淀粉产酒精的能力，改进后的酿酒酵母菌株具有了淀粉水解酶的活力，但是却仅限应用于酿酒工业。因此，一种能够同时高效表达葡萄糖淀粉酶和α-淀粉酶的其他种类的异源表达系统，并且可用于淀粉的液化和糖化领域，将具有更大的应用潜力和价值。然而至今都没有人将葡萄糖淀粉酶和α-淀粉酶同时表达在毕赤酵母中以进行相关研究，或者制备这两种酶的混合酶制剂。 

发明内容

本发明的目的是构建一种新型的共表达葡萄糖淀粉酶和α-淀粉酶的重组毕赤酵母菌株，及其构建方法，以及一种由该重组毕赤酵母菌株制备的混合酶制剂。 

本发明提供一种共表达葡萄糖淀粉酶和α-淀粉酶的重组毕赤酵母菌株，所述重组毕赤酵母菌株同时含有来自微小毛霉菌的葡萄糖淀粉酶基因和α-淀粉酶基因，其基因序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。 

所述重组毕赤酵母菌株能够同时分泌表达葡萄糖淀粉酶和α-淀粉酶。 

本发明还提供一种如上所述的重组毕赤酵母菌株的构建方法，所述构建方法的步骤如下：1）以微小毛霉菌基因组为模板，克隆得到葡萄糖淀粉酶（Gla）基因，其序列如SEQ ID NO.1所示，以pPIC9K为载体，构建重组表达载体pPIC9KGla，转入毕赤酵母KM71，得到重组毕赤酵母KM71/9KGla；2）以微小毛霉菌基因组为模板，克隆得到α-淀粉酶（Amy）基因，其序列如SEQ ID NO.2所示，以pPICZα为载体，构建重组表达载体pPICZαAmy；3）将所述重组表达载体pPICZαAmy转入重组毕赤酵母KM71/9KGla，通过抗生素筛选，得到同时含有葡萄糖淀粉酶基因和α-淀粉酶基因的重组毕赤酵母菌株KM71/9KGla-ZαAmy。 

步骤1）中从微小毛霉菌基因组克隆所述葡萄糖淀粉酶（Gla）基因的上、下游引物序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。 

步骤2）中从微小毛霉菌基因组克隆所述α-淀粉酶（Amy）基因的上、下 游引物序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。 

本发明还提供一种混合酶制剂，所述混合酶制剂由一种共表达葡萄糖淀粉酶和α-淀粉酶的重组毕赤酵母菌株制备，包括葡萄糖淀粉酶和α-淀粉酶。 

所述混合酶制剂的最适作用pH为4-5，优选为5。 

所述混合酶制剂的最适作用温度为60-80℃，优选70℃。