[发明专利]一种新型有机-无机复合纳米整体酶解柱的制备方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及蛋白质酶解技术领域，具体的说，是一种新型有机-无机复合纳米整体酶解柱的制备方法。

【背景技术】

以规模化分析细胞或生物体内蛋白质为主要任务的蛋白质组学研究已成为后基因组学研究的重要内容。蛋白质组学样品的复杂性和宽动态范围使得蛋白质鉴定成为研究的瓶颈。近年来，蛋白质经多维色谱分离后直接流出固定化酶解柱，分离后的蛋白质得以快速酶解后再直接用质谱鉴定。这项技术的核心为固定化酶解柱。固定化酶解柱可显著缩短蛋白质的酶解时间，减少酶的自降解，易于在线联用且可反复使用。所以这项技术得到突破，将大大加快蛋白组学的研究进程。

对于膜蛋白等具有重要生理功能的蛋白，由于其疏水性较强，而其跨膜区通常缺少精氨酸或赖氨酸残基，普遍采用的胰蛋白酶无法实现有效酶解和获得可信的蛋白质鉴定。利用不同蛋白酶对蛋白质切割特异性的差异并使其共同作用，将大大提高酶解效率，有助于质谱检测到互补性的肽段，进而提高鉴定结果的可信度。最近，Caterina制备了环氧硅胶整体基质双酶在线酶解柱，chymotrypsin和trypsin的共同存在不仅缩短酶解时间，而且提高酶解效率和蛋白鉴定的可信度。(Caterina T，Enrica C，Karin C，Guy F，Gabriella M，J.Sep.Sci.2009，32，1120-1128)，然而chymotrypsin和trypsin是同时与环氧基反应，所以酶之间存在相互酶解，影响酶的固定量。

【发明内容】

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种新型有机-无机复合纳米整体酶解柱的制备方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：将修饰活性基团的无机纳米材料掺杂到有机整体材料中，在毛细管中制备有机-无机复合基质；对整体材料改性，键合活性基团，并将一种蛋白酶与其结合，进一步将第二种蛋白酶结合到纳米材料表面的活性基团上，得到含有两种酶解蛋白的有机-无机复合纳米整体酶解柱。

一种新型有机-无机复合纳米整体酶解柱的制备方法，具体步骤如下：

一、有机-无机复合基质的制备

将修饰活性基团的无机纳米材料掺杂到有机整体材料中，20～80℃下反应12～24h，在毛细管中制备有机-无机复合基质；

所述的无机纳米材料为纳米二氧化硅、二氧化钛、氧化锌、石墨化碳中的一种；粒径为10nm～500nm；

所述的无机纳米材料的形状为球形、六方柱、棒状；且无机纳米材料表面修饰氨基或羧基活性基团；

所述的无机纳米材料的质量mg与有机整体材料的体积mL之比为2∶1～25∶1。

所述的有机整体材料为聚丙烯酰胺整体材料、聚甲基丙烯酸酯整体材料或其它高分子整体材料；

所述的无机纳米材料表面结合酶解蛋白，也可以通过在修饰活性基团的无机纳米材料上先固定一种蛋白酶的方式引入；

二、对有机整体材料改性，键合活性基团

将戊二醛溶液连续泵入步骤一得到的有机-无机复合基质中反应12～24h，对有机整体材料进行改性，在其表面化学键合，得到含醛基化的有机-无机复合基质；

所述的有机整体材料的改性，通过质量分数为5～10％的戊二醛引入醛基；

三、蛋白酶的固定

在0～10℃的条件下将含有1～10mg/mL第一种蛋白酶的磷酸盐缓冲液连续泵入到步骤二得到的有机-无机复合基质中反应12～24h，将此种蛋白酶结合到醛基化的有机-无机复合基质表面；将含有0.1～1mol/L Cu(II)的水溶液通入键合第一种蛋白酶的有机-无机复合基质反应2～10h，将Cu离子螯合到无机纳米材料表面的活性基团上，再进一步通入1～10mg/mL第二种蛋白酶磷酸盐缓冲液将第二种蛋白酶结合到无机纳米材料表面的铜离子上；最后用pH为7.0～8.5的缓冲液洗去未固定的第一种蛋白酶和第二种蛋白酶，得到含有两种酶解蛋白的有机-无机复合纳米整体酶解柱。

所述的两种蛋白酶是通过改性后有机整体材料表面的醛基的共价键合作用或氨基酸与铜离子的螯合作用得到固定；

所述的第一种蛋白酶为trypsin、Glu-C、proteinase K、chymotrypsin、elastase中的一种。

所述的第二种蛋白酶为trypsin、Glu-C、proteinase K、chymotrypsin、elastase中的一种。

所述的铜离子可通过CuSO4，CuCl₂，，CuNO₃溶液中任一种引入。