[发明专利]一种辣根过氧化物酶黑色显色剂及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种辣根过氧化物酶黑色显色剂及其制备方法与其在核酸/蛋白检测领域的应用。

背景技术

过氧化物酶标记和碱性磷酸酶(AP)标记显色技术是核酸和蛋白检测的两大基本技术。其中过氧化物酶标记是最为常用的标记，过氧化物酶一般是用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)，之所以叫这个名字是因为HRP是从一种称为辣根的植物根部分离纯化获得。HRP有以下几个方面的优点：(1)分子小(分子质量40kDa)，空间障碍小，穿透力强，易与细胞内抗原结合；(2)性质稳定且易获得高纯度酶制品；(3)活性高、特异性强；(4)酶反应产物易沉积，不扩散；(5)组织内源性酶活少，且抑制方法较多；(6)价格便宜；(7)特异性底物是过氧化氢(H₂O₂)，可选用不同电子供体(发色基团)，使终产物呈不同颜色。正因为如此，HRP标记显色成为了目前分子生物学化学显色中最为常用的一个技术。

HRP分子显色的原理是因为它含有活性基团高铁血红素(含铁血红素基团，在溶液中呈棕黄色)，HRP中的高铁血红素与H₂O₂形成一种复合物，然后脱水，氧原子形成。目前HRP的显色途径主要分为两类，一类是化学发光，X光片检测；另一类是化学显色，目标可视。化学发光是以鲁米诺为主要供氢体的ECL类显色剂，而化学显色目前常用的主要有四种基本底物：DAB，CN，AEC，TMB。DAB(3,3’-二氨基联苯胺)为棕褐色，AEC(3-氨基-9-乙基卡巴唑)为红色，4-CN(4-氯-1-萘酚)为蓝紫色，TMB(3′,3′,5′,5′,-四甲基联苯胺)为蓝色。AEC室温下较稳定，产物不溶于水，但溶于有机溶剂，所以不能进行脱水等处理；又因其需用水溶性封固剂，时间长易褪色，限制了其应用。DAB因为灵敏度高，产物既不溶于水，又不溶于有机溶液，可长期保存，其终产物具有嗜锇性，经锇酸处理后电子密度增加，适用于电镜下观察，成为了最广泛应用的电子供体。但DAB显色背景高。CN产物也不溶于水，背景低但灵敏度也较低。TMB产物溶于水，主要用在溶液状态上检测，如ELISA。为了兼顾灵敏度与最终显色效果，目前国外某著名公司开发有DAB和CN的混合显色剂(DAB/CN)，声称显色为黑色沉淀，显色极为灵敏，对比强烈，方便观察，但实际在膜上的应用发现，价格昂贵，且颜色虽然比传统的棕褐色偏黑，但仍然是强褐色。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种辣根过氧化物酶黑色显色剂的制备方法。

本发明的另一目的在于提供一种通过上述制备方法制备得到的辣根过氧化物酶黑色显色剂。

本发明的再一目的在于提供上述辣根过氧化物酶黑色显色剂的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种辣根过氧化物酶黑色显色剂的制备方法，包括如下步骤：

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种辣根过氧化物酶黑色显色剂，包括如下按质量百分比计的组分：

余量为1×TBS缓冲液(按《分子克隆》标准配制)，

优选的，一种辣根过氧化物酶黑色显色剂，包括如下按质量百分比计的组分：

余量为1×TBS缓冲液(按《分子克隆》标准配制)，

一种辣根过氧化物酶黑色显色剂通过上述制备方法制备得到。

所述的辣根过氧化物酶黑色显色剂的最终显色产物为黑色沉淀。

上述辣根过氧化物酶黑色显色剂在核酸/蛋白检测中的应用，所述的辣根过氧化物酶黑色显色剂用于辣根过氧化物酶显色。

本发明主要是辣根过氧化物酶催化DAB产生的褐色产物和4-CN的蓝紫色产物在所配制显色剂中各个成分复杂的物理化学反应下快速形成黑色的最终混合产物。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明提供的辣根过氧化物酶黑色显色剂兼具了DAB的高灵敏和4-CN色差视觉效果好的优点。

(2)本发明提供的辣根过氧化物酶黑色显色剂显色产物为黑色，与背景对比强烈，特别是用于免疫组织化学技术时，方便结果判断。

附图说明

图1是HRP标记核酸检测膜显色结果图。

图2是HRP标记蛋白检测膜显色结果图。

图3是内源RNA分子的检测膜显色结果图。

图4是内源蛋白分子的检测膜显色结果图。