[发明专利]一种表达猪表皮生长因子的重组嗜酸乳杆菌的构建方法及用途

权利要求书

1.一种表达猪表皮生长因子基因的重组益生菌的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）猪表皮生长因子基因的获得：提取猪下颌腺RNA，经过RT-PCR得到cDNA，以此cDNA为模板，设计合成含有Sac I和Xba I酶切位点的上下游引物P1和P2，上下游引物P1和P2分别具有猪egf基因（Gene ID：X59516.1）的序列，采用PCR方法扩增猪egf基因片段。将所扩增的egf目的基因片段与克隆载体pMD18-T载体连接，得到重组质粒，转入大肠杆菌DH5a中，经过氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆，并通过酶切鉴定和测序分析验证，验证正确的质粒命名为pMD18T-egf，重组质粒序列测定表明该质粒具有猪egf的基因序列。

（2）重组表达载体pMG36e-egf的构建：将乳酸菌表达载体pMG36e和克隆质粒pMD18T-egf用限制性内切酶Sac I和Xba I进行双酶切，纯化回收双酶切的线性化的pMG36e载体片段和egf目的基因片段，并将线性化的载体片段和目的基因片段进行连接，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞中，通过红霉素抗性筛选，挑取阳性克隆，提取重组质粒，酶切鉴定正确后，命名为pMG36e-egf，其具有猪egf的基因序列。

（3）表达猪表皮生长因子的重组嗜酸乳杆菌的构建：采用电转化方法将重组质粒pMG36e-egf转化入嗜酸乳杆菌NZ6092感受态细胞中，利用红霉素抗性进行筛选，得到重组菌，命名为：NZ6092-egf。

（4）猪表皮生长因子在嗜酸乳杆菌中的诱导表达及SDS、Western Blot分析：挑取重组菌NZ6092-egf接种于含有100ug/mL红霉素的MRS液体培养基中，诱导表达。得到大小为6Kda左右的蛋白条带。

2.根据权利要求1所述的一种表达猪表皮生长因子基因的重组益生菌的用途，其特征在于：所述的表达猪表皮生长因子基因的重组益生菌通过饮水或饲料中添加，促进猪胃肠道健康,防治仔猪腹泻的发生，提高生长性能。