[发明专利]一种表达猪表皮生长因子的重组嗜酸乳杆菌的构建方法及用途

说明书

技术领域

本发明属于畜牧兽医技术领域，尤其涉及一种表达猪表皮生长因子的重组嗜酸乳杆菌的构建方法及其在促进猪肠道健康中的应用。 

背景技术

在当前，养猪业已成为关系国计民生的重要产业。在养猪生产中，仔猪是生长发育最快、饲料利用率最高、开发潜力最大的一个阶段，仔猪饲养的好坏直接影响猪整个饲养期的生产成绩。然而，仔猪阶段也是生存能力、生理机能最脆弱的阶段，仔猪死亡率通常占整个饲养期死亡率的70%。仔猪成活率低和生长缓慢是目前我国养猪生产中面临的主要问题，提高仔猪饲养成绩是保障养猪业快速发展的关键。 

动物肠道不仅是动物体内最大的消化吸收器官，是所有营养物质最终的吸收场所，同时也是体内最大的免疫器官，仔猪肠道健康发育是快速生长与高成活率的生理基础。新生仔猪由于肠道处于快速发育之中，结构与功能不完善，养分的消化吸收与免疫屏障功能有很大的局限性，难以适应营养与环境的变化，增加了饲养的困难。仔猪哺乳期间，初乳和常乳中都含有高水平的、可促进肠道发育和成熟的生长因子，如谷氨酰胺、表皮生长因子、类胰岛素生长因子和多胺等，断奶后，这些因子消失，对肠细胞生长、分化及细胞功能的发育产生不良影响。仔猪断乳后由于受营养、生理、环境和病原微生物等多种应 激因素的影响，导致肠道黏膜萎缩、肠道上皮完整性和肠道屏障作用被破坏以及肠道功能紊乱，引起消化不良、腹泻、生长抑制，甚至死亡。据统计，断奶仔猪腹泻率一般在20%～30%，腹泻死亡率占仔猪总死亡率的40％。因此，生产实际中迫切需要采取有效措施促进仔猪肠道健康发育、改善消化吸收与免疫屏障功能。       

猪表皮生长因子作为猪乳中含量较高的生长因子之一，它对初生仔猪胃肠道发育有着极其重要影响。早期断奶是缩短母猪生育周期的重要手段，而早期断奶导致的断奶应激是影响早期断奶仔猪生产性能的主要原因，通过在饲料中添加表皮生长因子可以缓解断奶应激。尽管猪表皮生长因子凭借其独特的理化特性以及显著的生理作用，作为饲料添加剂具有广阔的发展前景，但是目前生产的猪表皮生长因子都是从乳产品中获得或利用大肠杆菌表达系统表达所得，这两种途径都具有一定的局限性，从乳中分离猪表皮生长因子的量有限，很难满足市场需要，而利用大肠杆菌表达系统表达的猪表皮生长因子，由于宿主菌大肠杆菌的局限性不能直接作为饲料添加使用，存在着分离纯化的难题，增加了添加成本，很难满足市场需要，  

鉴于此本发明以公认安全的微生物嗜酸乳杆菌为载体菌，构建能够表达猪表皮生长因子的重组嗜酸乳杆菌，并以此重组嗜酸乳杆菌作为饲料添加剂。该载体菌属于革兰氏阳性菌，细胞壁不含内毒素的毒性成分，并具有促进动物消化道益生菌的生长，抑制有害菌的繁殖，改善肠道环境，增强动物免疫功能等多种作用，已作为益生菌饲料添加剂应用于畜禽生产中。而所表达的猪表皮生长因子可以促进损伤肠 道上皮的修复，达到预防腹泻的目的。因此开发仔猪用表达肠黏膜表皮生长因子的重组益生菌，在饲料业与养猪业中具有广阔的应用前景。目前国内在该领域的研究尚属空白。 

发明内容

本发明的目的是针对目前仔猪断奶应激导致的肠道损伤而不能有效修复，现有技术不足而无法解决的现状，提供一种重组嗜酸乳杆菌的构建方法及用途，研发一种能够促进仔猪肠道粘膜损伤修复的重组嗜酸乳杆菌。本发明的重组嗜酸乳杆菌既具有嗜酸乳杆菌对肠道微生态环境的维护功能，又可以发挥重组表皮生长因子对猪肠道损伤的修复功能，达到治疗仔猪因各种因素导致的肠道损伤继而引起的腹泻，增加仔猪的存活率，解决生猪养殖过程中的瓶颈问题。 

本发明的目的可通过下述技术方案来实现： 

一种表达猪表皮生长因子的重组嗜酸乳杆菌的构建方法，包括以下步骤： 

（1）猪表皮生长因子基因的获得：提取猪下颌腺RNA，经过RT-PCR得到cDNA，以此cDNA为模板，设计合成含有Sac I和Xba I酶切位点的上下游引物P1和P2，上下游引物P1和P2分别具有猪egf基因（Gene ID：X59516.1）的序列，采用PCR方法扩增猪egf基因片段。将所扩增的egf目的基因片段与克隆载体pMD18-T载体连接，得到重组质粒，转入大肠杆菌DH5a中，经过氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳 性克隆，并通过酶切鉴定和测序分析验证，验证正确的质粒命名为pMD18T-egf，重组质粒序列测定表明该质粒具有猪egf的基因序列。