[发明专利]一种抗前列腺癌赤魟软骨蛋白多肽及其制备方法和用途

权利要求书

1.一种抗前列腺癌赤魟软骨蛋白多肽，其特征在于该抗前列腺癌赤魟软骨蛋白多肽的氨基酸序列为Ile-Glu-Pro-His（IEPH），ESI/MS检测给出分子离子峰m/z 495.96 Da（[M+H]⁺）。

2.一种权利要求1所述的一种抗前列腺癌赤魟软骨蛋白多肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）以赤魟软骨作为原料，按固液比1 g：3~8mL加入抽提液（含0.02 mol/L 2-N-吗啡啉乙磺酸和质量体积分数为0.02%EDTA的1.0 mol/L盐酸胍溶液），于18~20 ℃振荡抽提48~72 h，抽提溶液于4 ℃以下，以9 000 r/min离心15~25 min，去除沉淀，得赤魟软骨蛋白粗提液；

2）赤魟软骨蛋白粗提液内加入丙酮至丙酮浓度达30%，静置0.5~1 h后，于4 ℃以下，9 000 r/min离心15~25 min，取离心上清液加入丙酮至丙酮浓度达60%，静置0.5~1 h后，4 ℃以下，9 000 r/min离心15~25 min，取沉淀于截留分子量为3 kDa 的透析袋内透析24~36 h, 透析液冷冻干燥，得赤魟软骨蛋白；

3）取赤魟软骨蛋白，按照料液比1:3加入磷酸盐缓冲液（0.02 mol/L，pH 7.5~8.5），按照软骨粗蛋白质量的1.5~2.5%加入胰蛋白酶，于温度35~45℃下酶解3~5 h，得酶解产物；

4）将制备的赤魟软骨蛋白酶解产物先经灭酶处理得赤魟软骨蛋白酶解液，再将酶解液依次经超滤、脱盐和层析，得到抗前列腺癌赤魟软骨蛋白多肽。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤3）中的胰蛋白酶的酶活力≥2.5×10⁴ U/g。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤4）中的灭酶处理为：将酶解产物升温至90 ℃~ 95℃，并于此温度保持10 min~15min后，冷却至室温，然后离心，得酶解液。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤3）的超滤、脱盐和层析的具体过程为：

超滤：将赤魟软骨蛋白酶解液于0.1~0.15 MPa的工作压力和20~25 ℃的工作温度下采用1 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1 kDa部分，得超滤酶解液；

脱盐：将得到的超滤酶解液制成浓度为10~20 mg/mL溶液，加入到大孔树脂层析柱进行脱盐，然后用质量浓度70~80%乙醇进行洗脱，得脱盐酶解液，脱盐酶解液于50 ℃以下低压旋蒸除去乙醇后，冷冻干燥得脱盐酶解物干粉；

层析：将上述脱盐酶解物干粉溶于双蒸水配成浓度为10~20 mg/mL的溶液，经过阴离子交换树脂分离，用水、0.09~0.11 mol/L、0.45~0.55 mol/L和0.90~1.10 mol/L NaCl溶液进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对前列腺癌细胞DU-145和PC-3的增殖抑制率最高组分为离子交换层析酶解液；将上述离子交换层析酶解液用双蒸水配成8~12 mg/mL的溶液，经过凝胶柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对前列腺癌细胞DU-145和PC-3的增殖抑制率最高组分为凝胶层析酶解物，将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成45~55 μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）进行纯化，根据对前列腺癌细胞DU-145和PC-3的增殖抑制率得1个高活性抗前列腺癌多肽Ile-Glu-Pro-His（IEPH）。

6.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述大孔树脂为D101。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述阴离子交换树脂为DEAE-52纤维素，所述凝胶为葡聚糖凝胶G-25；所述反相高效液相色谱条件为：进样量19~21 μg；色谱柱为Zorbax C18；流动相：A水，B乙腈；梯度洗脱：0~6 min为100%水，6~25 min乙腈浓度从0匀速升至40%；洗脱速度1.0 mL/min；紫外检测波长220 nm。